本文選題：地衣芽孢桿菌　切入點(diǎn)：γ-聚谷氨酸(γ-PGA)　出處：《華中農(nóng)業(yè)大學(xué)》2016年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)是革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌,廣泛地應(yīng)用于多個(gè)領(lǐng)域:在農(nóng)業(yè)方面,它可以作為一種益生菌和微生物肥料;在生物制造產(chǎn)業(yè),它可以用來(lái)生產(chǎn)各種酶、抗生素、乙偶姻、2,3-丁二醇和γ-聚谷氨酸(Poly-γ-glutamic acid,γ-PGA)等產(chǎn)品。γ-PGA是一種多聚氨基酸高分子聚合物,對(duì)環(huán)境以及人體無(wú)害,能夠作為重金屬吸附劑、保濕劑、肥料吸收促進(jìn)劑、飼料營(yíng)養(yǎng)助劑等,廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、食品、飼料、化妝品、醫(yī)藥和污水處理等領(lǐng)域。本研究中的地衣芽孢桿菌WX-02菌株主要是從應(yīng)城鹽漬土中分離得到的。它在正常條件下可以合成γ-PGA,在高鹽,高溫等脅迫環(huán)境下可以高產(chǎn)γ-PGA。本論文綜合性地分析了地衣芽孢桿菌的基因組、轉(zhuǎn)錄組、生物網(wǎng)絡(luò),并結(jié)合這幾方面系統(tǒng)地研究了其代謝產(chǎn)物γ-PGA的合成調(diào)控及其在鹽脅迫條件下高產(chǎn)的分子機(jī)理,取得了以下幾方面研究結(jié)果:(1)完整地解析了地衣芽孢桿菌WX-02菌株的基因組信息,其基因組由長(zhǎng)度為4286821 bp的一條環(huán)狀染色體組成,含有4512個(gè)蛋白編碼基因,24個(gè)rRNA基因及79個(gè)tRNA基因,GC含量為46.1%。(2)基于地衣芽孢桿菌WX-02完整的基因組信息,本研究測(cè)得了其在非鹽脅迫和鹽脅迫條件下三個(gè)時(shí)間點(diǎn)的鏈特異性轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù):11th h(不加入6%NaCl);22th h(加入6%NaCl后11h,短期鹽脅迫);33th h(加入6%NaCl后22h,長(zhǎng)期鹽脅迫)。基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析識(shí)別了90個(gè)sRNA,1169個(gè)反義轉(zhuǎn)錄本(對(duì)應(yīng)734個(gè)正義鏈基因)及871個(gè)操縱子結(jié)構(gòu)。另外,通過(guò)DEGseq軟件分析比較了非鹽脅迫和鹽脅迫條件下的差異表達(dá)基因(FDR≤0.001,|log2FC|≥1),發(fā)現(xiàn)相對(duì)于11th h而言,分別有234和1439個(gè)基因在22th h顯著性的上調(diào)和下調(diào)表達(dá);在33th h,分別有229和1427個(gè)基因顯著性的上調(diào)和下調(diào)表達(dá)。而22th h和33th h只有133個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生顯著性變化。上述結(jié)果表明,在鹽脅迫條件下大部分基因的表達(dá)水平都被顯著性抑制,而短期鹽脅迫和長(zhǎng)期鹽脅迫條件下的基因表達(dá)水平變化并不明顯。差異表達(dá)基因中與能量代謝、氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)等相關(guān)的功能類(lèi)基因上調(diào)和下調(diào)的數(shù)量基本相當(dāng),表明這些基因在鹽脅迫條件下大部分被激活,從而能夠提供足夠的底物和能量來(lái)維持細(xì)胞生存。鹽脅迫條件下,氨基酸合成相關(guān)基因,特別是與谷氨酸和脯氨酸代謝相關(guān)基因的表達(dá)水平都發(fā)生顯著性變化,如gltABC(共同編碼谷氨酸-α-酮戊二酸酰胺轉(zhuǎn)移酶),gltP(谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體)及ycgMNO等都上調(diào)表達(dá)了,而gudB(編碼谷氨酸脫氫酶)則下調(diào)表達(dá)了,這些基因表達(dá)水平的變化都直接或間接地促進(jìn)了谷氨酸產(chǎn)量的增加,從而使得γ-PGA在鹽脅迫環(huán)境下能夠高產(chǎn)。(3)本研究基于直系同源及結(jié)構(gòu)域映射方法構(gòu)建了地衣芽孢桿菌WX-02全基因組水平的蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)。并從蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)特征,功能相似性及轉(zhuǎn)錄水平相關(guān)性三方面對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行了評(píng)估,最終網(wǎng)絡(luò)含有2448個(gè)蛋白及15864個(gè)PPIs,且具有高度準(zhǔn)確性。結(jié)合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),我們探究了非鹽脅迫和鹽脅迫條件下PPI網(wǎng)絡(luò)的動(dòng)態(tài)變化,分別對(duì)比分析了三個(gè)時(shí)間點(diǎn)(11th h,22th h,33th h)對(duì)應(yīng)的PPI網(wǎng)絡(luò),發(fā)現(xiàn)非鹽脅迫和鹽脅迫條件下PPI網(wǎng)絡(luò)沒(méi)有明顯的變化且基本不受外界環(huán)境影響。另外,通過(guò)網(wǎng)絡(luò)識(shí)別了267個(gè)不同的蛋白復(fù)合體,并注釋出117個(gè)未知蛋白的功能。通過(guò)分析γ-PGA相關(guān)的子網(wǎng)絡(luò),發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子CcpA與多數(shù)γ-PGA合成及調(diào)控相關(guān)的蛋白具有直接或間接的互作關(guān)系,如PgsB,GltA,GltB,Pro B,ProJ,YcgM及雙信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)Com P-ComA和DegS-DegU。由此推斷CcpA可能在γ-PGA合成及調(diào)控中起到一個(gè)非常至關(guān)重要的作用。(4)為進(jìn)一步研究地衣芽孢桿菌WX-02的基本代謝情況及γ-PGA合成調(diào)控相關(guān)的重要代謝物及路徑,本研究基于地衣芽孢桿菌WX-02的基因組注釋信息及目前已有的代謝信息構(gòu)建得到了其代謝網(wǎng)絡(luò)模型i WX1009,該模型含有1009個(gè)基因,1141個(gè)代謝物及1761個(gè)反應(yīng)。初步得到的代謝網(wǎng)絡(luò)模型通過(guò)PM表型芯片實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了校正和評(píng)估,i WX1009和表型芯片實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)具有76.8%的一致性。表明網(wǎng)絡(luò)模型具有高度可靠性,能夠很好地模擬真實(shí)的代謝情況。通過(guò)iWX1009模型模擬,發(fā)現(xiàn)在LB培養(yǎng)基中地衣芽孢桿菌WX-02含有195個(gè)重要基因,且其中149個(gè)可以被枯草芽胞桿菌(B.subtilis)168實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證實(shí)。另外通過(guò)優(yōu)化γ-PGA生產(chǎn)相關(guān)的代謝路徑,發(fā)現(xiàn)從網(wǎng)絡(luò)中移除5個(gè)反應(yīng)(rxn00800,rxn00097,rxn05164,rxn05299及rxn00047)可以使得γ-PGA的產(chǎn)量最大化。另外通過(guò)網(wǎng)絡(luò)模型我們分析推導(dǎo)出了γ-PGA合成的相關(guān)代謝物及代謝路徑。本研究應(yīng)用系統(tǒng)生物學(xué)方法探究了調(diào)控γ-PGA合成的潛在因子、代謝物及代謝路徑,初步闡明了γ-PGA的代謝調(diào)控機(jī)理,為構(gòu)建γ-PGA高效規(guī)�；a(chǎn)的基因工程菌株奠定了理論基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：Q93

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本文編號(hào)：1626173