本文選題：樹(shù)干畢赤酵母　切入點(diǎn)：木質(zhì)纖維素　出處：《四川農(nóng)業(yè)大學(xué)》2016年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：木質(zhì)纖維素,因其具有可再生性、價(jià)格低廉以及來(lái)源廣泛等諸多優(yōu)點(diǎn),被認(rèn)為是燃料乙醇生產(chǎn)的最佳原料。然而,所有的發(fā)酵微生物均不能直接有效地發(fā)酵木質(zhì)纖維素生成乙醇,必須在發(fā)酵前進(jìn)行預(yù)處理。在此過(guò)程中,不可避免地會(huì)產(chǎn)生對(duì)發(fā)酵微生物有強(qiáng)烈抑制作用的有毒副產(chǎn)物,即抑制因子。在眾多的抑制因子中,醛類(lèi)是最為關(guān)鍵的抑制因子。與天然的發(fā)酵微生物釀酒酵母相比,樹(shù)干畢赤酵母不僅能發(fā)酵木質(zhì)纖維素水解產(chǎn)物中的五碳糖,而且還能分泌多種能降解木質(zhì)纖維素的水解酶。因此,該酵母菌被認(rèn)為是較為理想的木質(zhì)纖維素乙醇發(fā)酵微生物。人們已對(duì)釀酒酵母中與醛類(lèi)脫毒相關(guān)的酶基因進(jìn)行了較為深入的研究,而對(duì)樹(shù)干畢赤酵母的研究還未見(jiàn)報(bào)道。由于這兩種酵母菌在分類(lèi)上存在較遠(yuǎn)的親緣關(guān)系,必須對(duì)樹(shù)干畢赤酵母中與醛類(lèi)脫毒相關(guān)的酶基因單獨(dú)開(kāi)展研究。本論文以樹(shù)干畢赤酵母(Scheffersomyces stipites)模式菌株CBS 6054為實(shí)驗(yàn)材料,借鑒釀酒酵母研究中的結(jié)果,選擇了樹(shù)干畢赤酵母基因組中3個(gè)基因家族SsADH、SsAAD、SsALD以及1個(gè)單獨(dú)SsGRE2基因作為目的基因,開(kāi)展了這些基因?qū)﹃P(guān)鍵醛類(lèi)抑制因子糠醛和5-羥甲基糠醛的轉(zhuǎn)錄應(yīng)答分析。然后將這些基因分別在釀酒酵母中進(jìn)行過(guò)量表達(dá)及表達(dá)蛋白的功能分析,同時(shí)開(kāi)展了編碼蛋白的氨基酸序列分析,獲得實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：(1)通過(guò)細(xì)胞生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)的比較分析,發(fā)現(xiàn)樹(shù)干畢赤酵母的生長(zhǎng)在初期會(huì)受到糠醛或5-羥甲基糠醛的抑制,經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的遲滯期后又會(huì)重新恢復(fù)細(xì)胞生長(zhǎng)。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)技術(shù),我們開(kāi)展了樹(shù)干畢赤酵母中3個(gè)基因家族SsADH、SsAAD、SsALD以及1個(gè)單獨(dú)SsGRE2基因共20個(gè)目的基因在遲滯期內(nèi)對(duì)糠醛或5-羥甲基糠醛應(yīng)激條件下轉(zhuǎn)錄變化的絕對(duì)定量分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在SsADH家族的7個(gè)基因中,SsADH4和SsADH6的轉(zhuǎn)錄水平在糠醛和5-羥甲基糠醛應(yīng)激條件下均有了顯著提高,轉(zhuǎn)錄數(shù)量最高上調(diào)了150倍。在SsAAD家族的5個(gè)基因中,SsAAD3在糠醛和5-羥甲基糠醛應(yīng)激條件下均顯著提高,轉(zhuǎn)錄數(shù)量最高上調(diào)8倍。SsGRE2在糠醛和5-羥甲基糠醛應(yīng)激條件下均顯著提高,轉(zhuǎn)錄數(shù)量最高上調(diào)了26.5倍。在SsALD家族的7個(gè)基因中,SsALD6在糠醛應(yīng)激條件下轉(zhuǎn)錄數(shù)量上調(diào)了5.5倍,SsALD3在5-羥甲基糠醛應(yīng)激條件下表達(dá)量上調(diào)1.5倍。其它基因的表達(dá)量在這兩種醛應(yīng)激條件下無(wú)明顯上調(diào),有的甚至出現(xiàn)下降。(2)采用PCR技術(shù)擴(kuò)增獲得了20個(gè)目的基因的編碼序列,分別構(gòu)建了重組穿梭質(zhì)粒,并且在釀酒酵母實(shí)驗(yàn)菌株中獲得了成功表達(dá)。表達(dá)蛋白的酶學(xué)性質(zhì)研究發(fā)現(xiàn),在SsADH家族中,SsAdh4p、SsAdh5p、SsAdh6p以及SsAdh7p可同時(shí)以NADH和NADPH為輔酶對(duì)糠醛有活性,而SsAdh1p只能以NADH為輔酶對(duì)糠醛有活性。SsAdh4p、SsAdh5p、SsAdh6p以及SsAdh7p只能以NADPH為輔酶對(duì)5-羥甲基糠醛有活性。這些酶催化反應(yīng)的最適pH均為6.0,最適溫度均為30℃。在以NADH為輔酶時(shí),SsAdh7p對(duì)糠醛的親和力最強(qiáng)(Km,1.94±0.02 mM)；而在以NADPH為輔酶時(shí),SsAdh4p對(duì)糠醛和5-羥甲基糠醛催化的親和力最強(qiáng)(Km,0.24±0.02mM和0.26±0.03 mM)。在SsAAD家族中,所有的5個(gè)編碼蛋白均能以NADH為輔酶對(duì)糠醛有活性,而僅有SsAad2p在以NADPH為輔酶時(shí)對(duì)5-羥甲基糠醛有活性。所有蛋白催化糠醛和5-羥甲基糠醛反應(yīng)的最適pH值在6.0-7.0之間,適溫度在30℃左右。在以NADH為輔酶時(shí),SsAad4p對(duì)糠醛的親和力最強(qiáng)(Km,3.24±0.03 mM),但SsAad5p對(duì)糠醛的催化效率最高(Kcat/Km,78.51±1.82 mM-1 min-1)。SsGre2p能利用兩種輔酶對(duì)糠醛表現(xiàn)出活性,但僅能利用NADPH為輔酶對(duì)5-羥甲基糠醛表現(xiàn)出活性。以NADH為輔酶催化糠醛反應(yīng)時(shí)的最適pH值為6.0,以NADPH為輔酶催化糠醛和5-羥甲基糠醛反應(yīng)時(shí)的最適pH值均為7.0。以NADH和NADPH為輔酶還原糠醛時(shí)的最適溫度均為20 ℃,但以NADPH為輔酶還原5-羥甲基糠醛時(shí)的最適溫度則為40 ℃。在以NADH為輔酶情況下,SsGre2p對(duì)糠醛的親和力最強(qiáng)(Km,0.36 mM)。在SsALD家族中,無(wú)論是以糠醛還是5-羥甲基糠醛為底物,在兩種輔酶的作用下所有目的蛋白均表現(xiàn)出較弱的催化活性。(3)以其它9種醛類(lèi)(大部分為木質(zhì)纖維素水解液中的醛類(lèi)因子)為底物的酶活實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),在SsADH家族中,大多數(shù)蛋白對(duì)大部分的供試醛表現(xiàn)出活性。SsAdh1p在以NADH為輔酶時(shí)對(duì)乙醛的活性最高(883.07±8.23 U/mg)。在SsAAD家族中,SsAad2p和SsAad3p在以NADH為輔酶時(shí)對(duì)7種以上的醛表現(xiàn)出活性。而SsAad4p則在以NADPH為輔酶時(shí)對(duì)6種醛表現(xiàn)出活性。其中SsAad2p在以NADH為輔酶時(shí)對(duì)乙醛的活性最高(208.45±5.36 U/mg)。SsGre2p對(duì)所有的供試醛類(lèi)都表現(xiàn)出活性。在以NADPH為輔酶時(shí)對(duì)苯乙醛的活性最高(25.72±0.29 U/mg)。在SsALD家族中,SsAld1p、SsAld4p和SsAad7p對(duì)供試醛類(lèi)的活性較為廣泛。其中SsAld1p在以NADH為輔酶時(shí)對(duì)乙醛的活性最高(112.83±4.02 U/mg)。(4)目的蛋白的氨基酸序列分析結(jié)果顯示,SsADH家族中的7個(gè)蛋白均屬于中鏈脫氫酶(MDR),SsAAD家族中的5個(gè)蛋白,除SsAad1p屬于短鏈脫氫酶(SDR)之外,其余蛋白均屬于具有鋅離子結(jié)合位點(diǎn)的中鏈脫氫酶(MDR)。而SsGre2p屬于短鏈脫氫酶(SDR)。同時(shí),在所有的20個(gè)目的蛋白氨基酸序列中,發(fā)現(xiàn)了一些相應(yīng)的保守序列。例如,輔酶結(jié)合區(qū)域和催化區(qū)域等。本論文研究從樹(shù)干畢赤酵母基因組測(cè)序推定的可能編碼醛還原酶基因中,成功鑒定出了對(duì)木質(zhì)纖維素水解醛類(lèi)具有脫毒能力的基因。初步探討了這些基因?qū)啡┖?-羥甲基糠醛的轉(zhuǎn)錄應(yīng)答反應(yīng),較為系統(tǒng)地分析了編碼蛋白的酶學(xué)性質(zhì)。通過(guò)綜合比較分析,發(fā)現(xiàn)了樹(shù)干畢赤酵母中在糠醛和5-羥甲基糠醛脫毒中最為關(guān)鍵的酶基因及參與脫毒的機(jī)理。本研究還發(fā)現(xiàn)了一些在其它醇類(lèi)燃料生產(chǎn)中具有潛力的醛還原酶基因。本論文研究獲得的成果,有助于增加對(duì)樹(shù)干畢赤酵母對(duì)木質(zhì)纖維素水解醛類(lèi)抑制因于脫毒機(jī)制的了解,可為新酶的開(kāi)發(fā)利用提供借鑒與參考,為樹(shù)干畢赤酵母醛類(lèi)抑制因子耐受的育種改造提供指導(dǎo),為推進(jìn)木質(zhì)纖維素燃料乙醇的工業(yè)化生產(chǎn)做出貢獻(xiàn)。
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【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：TS261.1;Q78

【參考文獻(xiàn)】

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1 武小芬;陳亮;陳靜萍;蘇小軍;王克勤;;木質(zhì)纖維素類(lèi)生物質(zhì)轉(zhuǎn)化為燃料乙醇關(guān)鍵技術(shù)研究現(xiàn)狀[J];湖南農(nóng)業(yè)科學(xué);2013年23期

2 李科;靳艷玲;甘明哲;劉曉風(fēng);趙海;;木質(zhì)纖維素生產(chǎn)燃料乙醇的關(guān)鍵技術(shù)研究現(xiàn)狀[J];應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào);2008年06期

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本文編號(hào)：1624337