本文選題：冷凍電子顯微學　切入點：單顆粒重構技術　出處：《清華大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：結構生物學作為現(xiàn)代生命科學的前沿和帶頭學科之一,在對生命現(xiàn)象與規(guī)律的研究中發(fā)揮著舉足輕重的作用。結構生物學研究手段主要有X-射線晶體學,核磁共振波譜學(NMR)及冷凍電子顯微學(Cryo-EM)等,每種方式都有其相應的特點。X-射線晶體學適用于分子量較小的蛋白質(zhì),需要蛋白質(zhì)能夠形成規(guī)則的三維晶體,利用晶體衍射數(shù)據(jù)解析得到三維結構。核磁共振波譜學可以測定不同溶液狀態(tài)下的結構,用于研究分子的柔性、分子間的相互作用、分子的動態(tài)特征等,但是對于分子量的局限性很大,只適用于分子量比較小的蛋白質(zhì)(40-50 kDa)。相比之下,冷凍電鏡技術不需要蛋白質(zhì)結晶,且適用于分子量較大的蛋白質(zhì),因此成為研究生物大分子結構的首選。由于冷凍電鏡成像技術及數(shù)據(jù)處理方式的發(fā)展,直接電子探測器、圖像漂移校正算法及三維分類技術的出現(xiàn),使得該領域取得了突破性進展。近兩年涌現(xiàn)出了大批冷凍電鏡高分辨結構,冷凍電鏡逐漸成為結構生物學中最重要的研究手段之一。盡管冷凍電鏡解析高分辨結構已經(jīng)成為可能,但是對于如何進行結構解析,如何優(yōu)化解析過程仍有許多問題需要解決。針對不同的研究對象,具體的結構解析方案也不盡相同,需要經(jīng)過摸索和嘗試才能找到最合適的方法解析得到高分辨結構。本論文建立和完善了有關高分辨冷凍電鏡單顆粒的重構方法,尤其是螺旋體單顆粒重構方法。論文中首先對電子顯微學成像原理及三維重構原理進行簡單介紹。在此基礎之上,以人源T4-γ-secretase及人源Rad51與DNA形成的螺旋纖維結構解析為例,詳細闡述冷凍電子顯微學高分辨結構解析如何進行。在結構解析過程中,進行了多種嘗試,最終獲得近原子分辨率結構,通過原子模型搭建及結構分析,為其生物學功能提供了結構基礎,同時也為相應的生物學問題提供了結構依據(jù)。在人源T4-γ-secretase中解析得到了4.32?的結構,電鏡結構揭示了γ-secretase四組分的組裝機制,為后續(xù)γ-secretase的結構及功能研究提供了結構依據(jù)。在Rad51課題中,解析得到了pre-synaptic和post-synaptic復合物高分辨結構,獲得了鏈間交換的可能中間態(tài)結構,為Rad51介導的DNA修復提供了結構基礎。上述例子中,高分辨結構解析方法是根據(jù)樣品摸索得到的,說明冷凍電鏡高分辨結構解析仍需要進行方法學探索,冷凍電鏡單顆粒重構方法研究具有重要意義。
[Abstract]:As one of the leading subjects in modern life sciences, structural biology plays an important role in the study of life phenomena and laws. Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR) and Frozen Electron Microscopy (Cryo-EMN), each method has its own characteristics. X- ray crystallography is suitable for proteins with small molecular weights, and requires proteins to form regular three-dimensional crystals. The three-dimensional structure can be obtained by using crystal diffraction data. Nuclear magnetic resonance spectroscopy can be used to study the flexibility of molecules, the interaction between molecules, the dynamic characteristics of molecules, and so on. However, the limitation of molecular weight is very great, and it is only suitable for proteins with relatively small molecular weight, which is 40-50 kDa. By contrast, the cryopreservation electron microscopy does not require protein crystallization, and is suitable for proteins with high molecular weight. As a result of the development of cryo-electron microscopy imaging technology and data processing, direct electronic detectors, image drift correction algorithms and three-dimensional classification techniques have emerged. This has made a breakthrough in this field. In the last two years, a large number of high resolution structures have emerged. Cryopreservation electron microscopy has gradually become one of the most important research methods in structural biology. There are still many problems to be solved on how to optimize the parsing process. It is necessary to find the most suitable method to analyze and obtain the high resolution structure. In this paper, the reconstruction method of single particle in high resolution cryopreservation electron microscope is established and improved. In this paper, the principle of electron microscopy imaging and the principle of three-dimensional reconstruction are briefly introduced. On this basis, the structure analysis of helical fibers formed by human T4- 緯 -secretase and human Rad51 and DNA is taken as an example. In the process of structure resolution, many attempts were made to obtain the near atomic resolution structure, and the atomic model was built and the structure was analyzed. It provides the structural basis for its biological function, and also provides the structural basis for the corresponding biological problems. In human T4- 緯 -secretase, 4.32? The structure and electron microscope structure of 緯 -secretase revealed the assembly mechanism of 緯 -secretase, which provided the structural basis for further study on the structure and function of 緯 -secretase. In the Rad51 project, the high-resolution structures of pre-synaptic and post-synaptic complexes were obtained. The possible intermediate structure of interchain exchange is obtained, which provides a structural basis for DNA repair mediated by Rad51. It shows that the resolution of high resolution structure of cryopreservation electron microscope still needs to be explored, and it is of great significance to study the method of single particle reconstruction of cryopreservation electron microscope.
【學位授予單位】：清華大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：Q617

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本文編號：1597873