本文關鍵詞：Streptomyces kathirae SC-1黑色素合成關鍵酶酪氨酸酶基因的克隆表達及分子改造，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《江南大學》 2015年

Streptomyces kathirae SC-1黑色素合成關鍵酶酪氨酸酶基因的克隆表達及分子改造

郭靜  

【摘要】：黑色素廣泛的存在于動植物及微生物中,是由酪氨酸酶催化酪氨酸而生成的一種非均質類的多酚聚合物,具有吸收紫外輻射、清除自由基、抗氧化、吸附重金屬離子、清除酚類化合物、作為新型的藥物載體等生理功能,此外,有研究表明黑色素在體外具有抗HIV活性,正是由于黑色素的應用價值使其在醫(yī)藥、化工、農藥等方面有廣闊的應用前景。雖然黑色素來源廣泛,但是較低的產量使黑色素的價格居高不下,進而限制其大規(guī)模的應用。為此,本論文采用傳統(tǒng)育種的方法,從環(huán)境中篩選獲得了一株黑色素高產菌株,結合蛋白工程、基因工程、代謝工程等技術進行了一系列有益研究工作:(1)以酪氨酸為底物,從自然界中篩選獲得一株色素高產菌株SC-1,經過紫外、紅外、質譜、核磁共振等檢測手段證明該色素為黑色素,依據《鏈霉菌鑒定手冊》的生理生化、培養(yǎng)特征及以16S r RNA序列為基礎的分子生物學鑒定手段,將菌株SC-1鑒定為S.kathirae。經128 h發(fā)酵,黑色素產量為0.8 g·L-1。(2)在搖瓶水平上優(yōu)化Streptomyces kathirae產黑色素發(fā)酵條件,并且采用響應面優(yōu)化S.kathirae產黑色素發(fā)酵培養(yǎng)基,確定S.kathirae SC-1產黑色素的最適發(fā)酵條件及最適培養(yǎng)基。培養(yǎng)基(g·L-1):可溶性淀粉4,酵母膏37,Na Cl 5,Ca Cl20.1,Cu SO4·5H2O1.341×10-2;培養(yǎng)條件:初始p H 6.0、溫度28°C、轉速200 r·min-1、接種量8%,發(fā)酵時間128 h。在此條件發(fā)酵,黑色素產量可達13.7 g·L-1,生產強度為0.11 g·L-1·h-1,較優(yōu)化前提高17.13倍。(3)通過(NH4)2SO4分級沉淀、強陰離子交換柱純化獲得S.kathirae酪氨酸酶。SDS-PAGE測定酪氨酸酶分子量為30 k Da,以左旋多巴為底物測定酪氨酸酶最適反應p H為6.2,最適反應溫度為45°C。Co2+、Ni2+和Cu2+對酪氨酸酶具有抑制作用,但是當Cu2+濃度為30μmol·L-1時,對氨酸酶酶活有促進作用,酪氨酸酶酶活可為未添加Cu2+活性的7.2倍。其他金屬離子在一定濃度范圍內對酪氨酸酶酶活具有促進作用,作用大小的順序為Al3+Mn2+K+Fe3+Na+Zn2+Ba2+Ca2+。硫脲、Tween-80、Triton X-100等添加劑在一定濃度范圍內對酶活有促進作用,抗壞血酸、β-巰基乙醇、二硫蘇糖醇、等添加劑對酶活有強烈抑制作用。以左旋多巴為底物酶動力學常數Km為0.42 mmol·L-1;Vmax為333.38μmol·mg-1·min-1。(4)以酪氨酸酶部分氨基酸序列為基礎,使用TAIL-PCR等分子生物學手段克隆獲得酪氨酸酶編碼基因及其5’端非編碼序列(553 bp),mel C包含酪氨酸酶金屬伴侶基因mel C1及酪氨酸酶基因mel C2,與以報道的酪氨酸酶編碼基因的最高同源性為84%。在S.lividans中驗證克隆獲得的mel C基因功能,證明只有共表達酪氨酸酶金屬伴侶與酪氨酸酶才可以得到有活性的酪氨酸酶。同時通過啟動子缺失實驗在S.lividans中驗證上游553 bp功能,證明mel C啟動子的有效序列位于-167 bp至-75 bp之間。為提高黑色素產量,在S.kathirae表達mel C基因使黑色素產量從13.7 g·L-1提高至28.8 g·L-1。(5)在E.coli BL21中使用雙RBS的表達策略優(yōu)化酪氨酸酶金屬伴侶及酪氨酸酶的表達量,同時對重組大腸桿菌產酪氨酸酶的條件進行了優(yōu)化,當誘導溫度為16°C、IPTG濃度為0.4 mmol·L-1、誘導時間為8 h時重組菌可以較好的生成重組酪氨酸酶。對重組酪氨酸酶酶學性質進行了研究發(fā)現其與野生型酪氨酸酶酶學性質并無太大區(qū)別。(6)為提高S.kathirae酪氨酸酶穩(wěn)定性,利用SWISS-MODEL以栗色渾圓鏈霉菌(S.castaneoglobisporus)酪氨酸酶(2AHL)為模板對S.kathirae酪氨酸酶的三維結構進行同源模擬,獲得了酪氨酸酶的三維結構。使用在線預測軟件Po PMu Si C-2.1計算酪氨酸酶每個突變氨基酸的去折疊自由能變化(ΔΔG)來輔助設計提高酪氨酸酶的穩(wěn)定性,確定與酪氨酸酶穩(wěn)定性相關的關鍵位點,將這些關鍵位點進行相應的替換,獲得了熱穩(wěn)定性提高的突變體Q7K、R95Y、G123W、G234P。在此基礎上進行組合突變,使酪氨酸酶的熱穩(wěn)定性進一步提高,最適溫度提高了10°C、T50提高了10°C,在60、65、70、75°C下的半衰期分別提高了3.52、3.18、3.29、3.14倍。在S.kathirae中表達酪氨酸酶突變體使黑色素產量進一步提高至32.6 g·L-1。

【關鍵詞】：
【學位授予單位】：江南大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：Q78;Q936
【目錄】：

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中國期刊全文數據庫 前10條

1 舒文,毛華明;黑色素的研究進展[J];國外畜牧學(豬與禽);2003年02期

2 朱琳;商倩倩;游偲;張艷;唐學璽;肖慧;;一株產黑色素海洋細菌的篩選、鑒定及發(fā)酵條件優(yōu)化[J];海洋環(huán)境科學;2011年05期

3 顧敏舟;湯建才;黃敏;;一株高產黑色素菌的篩選及發(fā)酵條件優(yōu)化[J];四川師范大學學報(自然科學版);2006年06期

4 鄭晨娜;金春英;方柏山;;高產黑色素放線菌G-HD-4的分離及鑒定[J];食品科學;2009年11期

5 鄭晨娜;羅婉妹;陳慧勤;吳曉嵐;方柏山;;鏈霉菌G-HD-4產黑色素發(fā)酵條件的優(yōu)化[J];食品科學;2010年13期

6 王斐;李俊霞;張麗香;梁志宏;王曉;牛天貴;;產黑色素菌株發(fā)酵條件的研究[J];食品科技;2008年05期

7 田欣欣;王琛;曹為;曲凌云;;產胞外黑色素海洋菌的鑒定及發(fā)酵條件優(yōu)化[J];應用海洋學學報;2014年02期

8 王玉潔,黃玉屏,阮麗芳,劉楠,沈萍;mel基因在釀酒酵母菌中的克隆和表達[J];微生物學通報;2003年04期

9 李建波,宋欣,曲音波;產胞外黑色素菌株的篩選[J];微生物學通報;2004年01期

10 倪麗娜;一株高產黑色素細菌的分離及鑒定[J];微生物學通報;2004年01期

中國博士學位論文全文數據庫 前1條

1 劉楠;蘇云金芽孢桿菌酪氨酸酶純化、性質研究及其mel基因的克隆和表達[D];武漢大學;2004年

中國碩士學位論文全文數據庫 前1條

1 柯冠群;高產黑色素菌株的篩選及其發(fā)酵條件與黑色素結構的初步研究[D];中國科學院研究生院（成都生物研究所）;2005年

【共引文獻】

中國期刊全文數據庫 前10條

1 司美茹;蘇濤;李桂芝;;濟寧市土壤放線菌資源調查研究[J];山東農業(yè)科學;2008年04期

2 邢鯤,韓巨才,劉慧平,張姝;辣椒內生放線菌的分離·鑒定和拮抗作用[J];安徽農業(yè)科學;2005年05期

3 王曉飛;薛春生;徐書法;劉力行;陳捷;;玉米彎孢菌黑色素性質及其在致病性中的作用研究[J];安徽農業(yè)科學;2007年21期

4 商瑞;彭燕;曾會才;陳漢清;;農抗鏈霉菌BM10菌株的初步研究[J];安徽農業(yè)科學;2008年23期

5 容杰;吳琦;劉文龍;雷蕾;陳惠;;一株沙雷氏菌紅色素的理化性質研究[J];安徽農業(yè)科學;2010年01期

6 常顯波;楊啟霞;劉英霞;;煙臺海岸海洋放線菌分布規(guī)律及抑菌活性研究[J];安徽農業(yè)科學;2010年05期

7 陳立;張發(fā)旺;張勝;張娟娟;張琳;陳江;;石油污染土壤的微生物生態(tài)原位修復研究[J];安徽農業(yè)科學;2010年26期

8 何建清;張格杰;岳海梅;;珠穆朗瑪峰自然保護區(qū)土壤放線菌的生態(tài)分布及拮抗性研究[J];安徽農業(yè)科學;2010年32期

9 竇會娟;李林珂;劉新勝;孫連海;;高抑制金黃色葡萄球菌活性放線菌的分離及分子鑒定[J];安徽農業(yè)科學;2011年09期

10 劉愛民,黃紅英,潘繼紅,張林普;安徽師大校園內土壤放線菌區(qū)系初步調查[J];安徽師范大學學報(自然科學版);2000年02期

中國重要會議論文全文數據庫 前8條

1 肖晶晶;郭萍;田云龍;于江;朱昌雄;;不同腐植酸原料中的微生物分離與鑒定[A];第六屆全國綠色環(huán)保肥料新技術、新產品交流會論文集[C];2006年

2 王成;林壁潤;王振中;沈會芳;蒲小明;;放線菌H74-18的分類鑒定[A];中國植物病理學會2008年學術年會論文集[C];2008年

3 鄭東光;陳建光;文才藝;;生防鏈霉菌SCY311的篩選與鑒定[A];河南省植保學會第九次、河南省昆蟲學會第八次、河南省植病學會第三次會員代表大會暨學術討論會論文集[C];2009年

4 何鴻洪;王濤;焦成;林緯;黎起秦;;番茄青枯病拮抗放線菌St-145菌株的鑒定[A];植物保護與現代農業(yè)——中國植物保護學會2007年學術年會論文集[C];2007年

5 馬井玉;李德舜;;山東鏈霉菌抗菌素對真菌作用機理的研究[A];中國植病、菌物學會杭州聯(lián)合年會論文集[C];2008年

6 吳斌;韋建福;;病原真菌黑色素和毒力之間的關系[A];中國植病、菌物學會杭州聯(lián)合年會論文集[C];2008年

7 劉一塵;張謙;丁軻;張春杰;余祖華;丁少成;;一株嗜線蟲沙雷氏菌玫瑰紅色素發(fā)酵條件的優(yōu)化[A];中國畜牧獸醫(yī)學會動物微生態(tài)學分會第十一次全國學術研討會暨第五屆會員代表大會論文集[C];2014年

8 楊縝;徐大友;賴璟琦;;酶的新型無載體固定化技術及其應用的研究[A];第九屆中國酶工程學術研討會論文摘要集[C];2013年

中國博士學位論文全文數據庫 前10條

1 王冰;降解絲素放線菌的分離鑒定、發(fā)酵條件優(yōu)化及其降解機制研究[D];山東農業(yè)大學;2009年

2 熊智強;還原型谷胱甘肽高產菌的脅迫生理特性與高密度發(fā)酵過程優(yōu)化技術[D];華東理工大學;2011年

3 劉詠梅;產精氨酸脫亞胺酶變形假單胞菌的篩選鑒定及酶的定向改造[D];江南大學;2010年

4 林錦霞;橙色珍貴束絲放線菌發(fā)酵生產抗癌藥物安絲菌素P-3的研究[D];華東理工大學;2011年

5 錢國良;產酶溶桿菌生防相關基因的克隆、功能分析及工程菌構建[D];南京農業(yè)大學;2009年

6 趙鶴云;解脂耶氏酵母脂肪酶家族的研究及新型表達系統(tǒng)的構建[D];華中科技大學;2012年

7 劉叔文;作用于HIV gp41的病毒融合抑制劑高通量篩選的方法學及天然來源的藥物篩選研究[D];第一軍醫(yī)大學;2002年

8 趙青余;微生物脫毒蓖麻餅及對綿羊機體影響的研究[D];中國農業(yè)科學院;2003年

9 劉占良;拮抗鏈霉菌Men-myco-93-63分類學鑒定及其幾丁質酶基因研究[D];河北農業(yè)大學;2003年

10 郭長偉;萬古霉素耐藥模型的建立以及抗耐藥菌化合物的分離[D];上海醫(yī)藥工業(yè)研究院;2003年

中國碩士學位論文全文數據庫 前10條

1 劉偉;海洋小鏈霉菌DY2741菌株抗菌活性物質的初步研究[D];安徽農業(yè)大學;2010年

2 沈麟;分子突變改善擴展青霉脂肪酶的耐熱性[D];福建師范大學;2009年

3 李路軍;雙孢蘑菇栽培基質中放線菌的分離鑒定及特性研究[D];山東師范大學;2011年

4 張茹萍;煙草黑脛菌拮抗放線菌的篩選、鑒定及其生防效果研究[D];山東農業(yè)大學;2011年

5 江翠翠;高效降解石油放線菌的分離篩選及其降解特性研究[D];曲阜師范大學;2011年

6 何歡;耐低溫防控蔬菜根結線蟲優(yōu)勢菌株鏈霉菌S205的篩選及鑒定[D];河北師范大學;2011年

7 張婷婷;海洋蝦殼的放線菌分離鑒定篩選及抑菌活性物質提取[D];福建農林大學;2011年

8 李佳;酶法制備羅非魚魚皮明膠的工藝研究[D];福建農林大學;2011年

9 李松偉;香蕉枯萎病生防放線菌綜合防控初步研究[D];海南大學;2011年

10 陳吉良;薯蕷炭疽病病原菌分離鑒定及抑菌制劑的篩選[D];海南大學;2011年

【二級參考文獻】

中國期刊全文數據庫 前10條

1 王玉潔,符堅,劉楠,沈萍,彭珍榮;重要的生物資源黑色素及其功能的機理[J];氨基酸和生物資源;2003年01期

2 彭方，王偉，彭珍榮;高產黑色素微生物資源的研究[J];氨基酸和生物資源;1996年04期

3 陳玢,彭珍榮;嗜麥芽假單胞菌黑色素的抗氧化作用研究[J];氨基酸和生物資源;1997年02期

4 彭方,彭珍榮;酪氨酸酶高產菌株的快速、簡便篩選方法[J];氨基酸和生物資源;1998年02期

5 王巖，劉學惠，陸懋蓀，，尹佩玉，容蓉;幾種天然黑色素分子結構的紅外光譜表征研究[J];分析試驗室;1996年06期

6 鄭晨娜;方柏山;羅菊香;靳鴻蔚;;鏈霉菌G-HD-4產黑色素的提取及理化性質[J];華僑大學學報(自然科學版);2009年03期

7 朱琳;商倩倩;游偲;張艷;唐學璽;肖慧;;一株產黑色素海洋細菌的篩選、鑒定及發(fā)酵條件優(yōu)化[J];海洋環(huán)境科學;2011年05期

8 李鵬;苗增良;王健鑫;;一株產黑褐色色素海洋放線菌的研究[J];海洋環(huán)境科學;2011年05期

9 吳志紅,汪天虹,黃衛(wèi),曲音波;簡便易行的絲狀真菌染色體DNA提取法[J];菌物系統(tǒng);2001年04期

10 張沙艷,胡春霞;毛發(fā)中黑色素的提取和利用[J];遼寧師專學報(自然科學版);2003年03期

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1 顧敏舟;一株高產黑色素菌的篩選培養(yǎng)及黑色素的初步研究[D];四川師范大學;2006年

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1 陳清西;宋康康;;酪氨酸酶的研究進展[J];廈門大學學報(自然科學版);2006年05期

2 羅士華;李少華;;植物組織培養(yǎng)中的酪氨酸酶[J];Journal of Integrative Plant Biology;1957年04期

3 李好樣;李永耀;韓紅斐;;蘋果中酪氨酸酶的提取及其催化活性研究[J];太原師范學院學報(自然科學版);2008年04期

4 樸香蘭;楊靜;樓彩霞;柏曉清;;連翹對酪氨酸酶的抑制活性[J];中央民族大學學報(自然科學版);2012年04期

5 李樹白;樊亞娟;顧月;;4-羥基苯乙酸對酪氨酸酶作用機理研究[J];科技創(chuàng)新導報;2013年01期

6 王端禮;秕糠孢子菌培養(yǎng)物中酪氨酸酶抑制物的鑒定[J];國外醫(yī)學.皮膚病學分冊;1979年04期

7 彭珍榮;;假單胞菌屬細菌產酪氨酸酶的研究[J];氨基酸雜志;1990年01期

8 高秀蕊;宋秀芹;陳會蘭;;抗壞血酸對酪氨酸酶的抑制效應[J];河北師范大學學報;1990年01期

9 胡笑莉,彭珍榮;酪氨酸酶產生菌誘變及其轉化條件的研究[J];氨基酸雜志;1991年03期

10 李新榮,汪洛,韓紅;植物酪氨酸酶分離純化過程中色素的去除[J];生物化學與生物物理進展;1992年02期

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1 胡泳華;劉軒;梁戈;賈玉龍;王勤;陳清西;;2,4-二氯苯丙烯酸的合成及其對蘑菇酪氨酸酶抑制機理的研究[A];第十屆全國酶學學術討論會論文集[C];2011年

2 陳清西;宋康康;劉曉丹;黃璜;;p-烷氧基苯甲酸作為抗褐變劑-抗酪氨酸酶氧化作用的抑制劑[A];華東六省一市生物化學與分子生物學會2003年學術交流會論文摘要集[C];2003年

3 莊江興;李文崗;邱凌;鐘雪;周晶晶;陳清西;;三種頭孢菌素類抗生素對酪氨酸酶抑作用[A];第九屆全國酶學學術討論會暨鄒承魯誕辰85周年紀念會論文摘要集[C];2008年

4 王英豪;魏國強;藍玉櫻;王剛;;酪氨酸酶抑制方的主效應中藥探究[A];'2012第五屆全國臨床中藥學學術研討會論文集[C];2012年

5 陳菊萍;;改良酪氨酸酶生物學活性檢測法的建立[A];中華醫(yī)學會第十二次全國皮膚性病學術會議論文集[C];2006年

6 戴玉柱;沈雄文;;人類血清酪氨酸酶測定方法的建立和評估[A];2008年浙江省檢驗醫(yī)學學術年會論文匯編[C];2008年

7 王偉;潘志針;胡泳華;劉鳳嬌;楊美花;陳清西;;烷基3,4-二羥基苯酚烷酸酯對酪氨酸酶的效應[A];華東六省一市生物化學與分子生物學會2009年學術交流會論文摘要匯編[C];2009年

8 邱凌;陳良華;鐘雪;明艷林;童慶宣;陳清西;;亞熱帶植物提取物對酪氨酸酶激活調控的研究[A];華東六省一市生物化學與分子生物學會2008年學術交流會論文摘要匯編[C];2008年

9 魏海柳;穆燕;姜銳;邱俊;李琳;張喜梅;胡松青;;超聲輔助提取白附子酪氨酸酶抑制劑的研究[A];2010年中國農業(yè)工程學會農產品加工及貯藏工程分會學術年會暨華南地區(qū)農產品加工產學研研討會論文摘要集[C];2010年

10 張智武;許建香;孫麗萍;;蜂膠對酪氨酸酶體外活性的影響[A];海峽兩岸第六屆蜜蜂與蜂產品研討會論文集[C];2007年

中國重要報紙全文數據庫 前7條

1 張正棋;[N];中國食品報;2009年

2 ;[N];大眾科技報;2004年

3 潘祥龍（上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院 副主任醫(yī)師）;[N];上海中醫(yī)藥報;2002年

4 程克銘;[N];民族醫(yī)藥報;2004年

5 湖北遠安縣中醫(yī)院主任醫(yī)師 胡獻國;[N];大眾衛(wèi)生報;2009年

6 常敏毅;[N];大眾衛(wèi)生報;2005年

7 河北 柴玉花;[N];民族醫(yī)藥報;2002年

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1 莊江興;α-synuclein蛋白及抑制劑對酪氨酸酶的調控機制[D];廈門大學;2009年

2 郭靜;Streptomyces kathirae SC-1黑色素合成關鍵酶酪氨酸酶基因的克隆表達及分子改造[D];江南大學;2015年

3 宋康康;抑制劑對酪氨酸酶的效應及其對黑色素生成調控的研究[D];廈門大學;2007年

4 王芳;桑葉中酪氨酸酶抑制成分的研究[D];浙江工商大學;2008年

5 黃曉偉;三種植物揮發(fā)油的化學成分、酪氨酸酶抑制能力及抗氧化活性的研究[D];華中科技大學;2013年

6 穆燕;千日紅酪氨酸酶抑制劑的分離純化及其抑制機理研究[D];華南理工大學;2012年

7 張永兵;竹葉提取物對酪氨酸酶和黑色素瘤細胞的影響[D];中國林業(yè)科學研究院;2009年

8 傅國強;中藥對體外黑素生成影響的研究[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學;2002年

9 朱祥枝;藥用柑果主要藥用成分及其對酪氨酸酶抑制作用研究[D];福建農林大學;2005年

10 劉楠;蘇云金芽孢桿菌酪氨酸酶純化、性質研究及其mel基因的克隆和表達[D];武漢大學;2004年

中國碩士學位論文全文數據庫 前10條

1 張曉晴;香樟果實酪氨酸酶的分離、純化和性質分析[D];江南大學;2008年

2 陳懿;二甲基亞砜對酪氨酸酶活性影響的研究[D];西北農林科技大學;2009年

3 張晶;常用�？浦兴幚野彼崦敢种苿┭芯縖D];華東理工大學;2011年

4 于雪;長牡蠣酪氨酸酶基因家族的克隆、表達和系統(tǒng)發(fā)生分析[D];中國海洋大學;2014年

5 張麗娟;苯甲酸衍生物對酪氨酸酶的效應及其抑菌作用[D];廈門大學;2006年

6 張廷紅;固定化酪氨酸酶的制備及部分性質研究[D];四川大學;2005年

7 馬景昕;中藥乙醇提取物對豚鼠皮膚酪氨酸酶mRNA水平的影響[D];大連醫(yī)科大學;2003年

8 張春樂;抑制劑對蘑菇酪氨酸酶的抑制效應及抗菌活性[D];廈門大學;2007年

9 汪雯;酪氨酸酶七肽抑制劑的篩選及其柔性脂質體的制備[D];東華大學;2012年

10 李超;與酪氨酸酶相互作用蛋白的鑒定和作用機制研究[D];蘇州大學;2014年

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