本文選題：牛心樸子　切入點：逆境脅迫轉錄組分析　出處：《中國農業(yè)大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：牛心樸子Cynanchum komarovii)是一種荒漠草本植物,具有殺蟲、抑菌、抗植物病毒等生物活性,被用于制備綠色農藥,其有極強的荒漠適應能力,在100mmm以下降雨量仍可存活,耐地面最高溫度67-96℃℃、最低溫度-29℃℃到-36℃℃,集耐早、耐高溫、耐冷等抗逆性于一身,是獲得抗逆優(yōu)異基因的好材料。本論文研究目的是明確植物耐旱、耐低溫的分子機理,在公共數(shù)據庫中填補牛心樸子可利用的基因序列和遺傳信息,為農作物耐旱、耐冷新品種培育提供基因資源。本文首次對牛心樸子逆境脅迫轉錄組進行分析,明確干旱、低溫脅迫下牛心樸子差異表達基因,探究牛心樸子耐旱、耐低溫的分子機制及其響應非生物脅迫的信號轉導機理,挖掘新型耐旱、耐低溫基因。本論文還研究牛心樸子耐旱基因CkNF-YB1、抗病基因CkEDS1的功能。主要研究結果如下：1、采用高通量Illumina HiSeq測序平臺對干旱脅迫下牛心樸子進行轉錄組測序,獲得27.5GB測序數(shù)據,組裝得到148715條Unigene,平均長度為604bp,其中85106條在7大公共數(shù)據庫比對中獲得功能注釋。KOG功能分類中有4364個Unigene與信號轉導相關。KEGG生物代謝途徑分析表明有29737個Unigene分別參與31個代謝途徑,其中有827個基因被鑒定與環(huán)境適應功能相關,2840個基因與信號轉導功能相關,426個基因與次級代謝產物的生物合成相關。在干旱脅迫下鑒定出3134個差異表達基因,其中上調基因601個。明確參與植物角質和蠟質生物合成的代謝途徑具有最大Rich factor,參與此生物過程的基因富集程度高,統(tǒng)計鑒定出參與蠟質合成、轉運及調節(jié)功能相關的差異基因26個。2、對低溫脅迫下牛心樸子進行轉錄組測序,獲得30.5GB測序數(shù)據,組裝得到100006條Unigene,平均長度為649bp,其中有47082條Unigene在7大公共數(shù)據庫比對中獲得功能注釋。KOG功能注釋中1779個與信號轉導機制相關的基因,以及有786基因被鑒定為與次生代謝合成、轉運和分解功能有關。KEGG生物代謝途徑分析鑒定出17695條Unigene參與轉錄、碳水化合物代謝、運輸及分解代謝等,其中有445個基因被鑒定為與環(huán)境適應功能相關,305個基因與信號轉導功能相關。在低溫脅迫下鑒定出7742個差異表達基因,其中上調基因3081個和下調基因4661個。對差異基因的GO功能與KEGG代謝途徑富集分析,植物激素信號轉導和淀粉與蔗糖代謝為主要的生物過程。參與類黃酮生物合成、黃酮與黃酮醇生物合成途徑具有最大Rich factor,表明在低溫脅迫下參與類黃酮生物合成途徑的基因富集程度高。對牛心樸子中響應低溫應答差異基因分析,鑒定出550個轉錄因子,包括MYB、 C3H、bHLH、AP2-EREBP等轉錄因子。3、以干旱轉錄組數(shù)據為參考序列,從牛心樸子中克隆轉錄因子CkNF-YB1,在其根和莖中表達量高,受到ABA與PEG6000誘導表達。CkNF-YB1與GFP熒光蛋白構建融合表達載體,其表達定位于細胞核內。利用酵母單雜交技術驗證單一的CkNF-YB1蛋白不具有轉錄激活活性。將CkNF-YB1基因轉入擬南芥野生型與nf-yb突變體中。表型實驗發(fā)現(xiàn)相對于野生型和突變體株系,過表達株系OE10和OE13在干旱脅迫條件下種子萌發(fā)率分別為76.00%和78.00%,含水量分別為65.50%和66.85%,相對電導率分別為36.56%和35.57%。耐旱相關基因的表達水平實驗分析表明,CkNF-YB過表達轉基因株系中RD29A、RD29B、CBF4和KIN1表達量高于野生型植株。實驗證明CKNF-YB1提高了轉基因植株在干旱脅迫條件下的耐受能力。4、以牛心樸子轉錄組數(shù)據為參考序列,從牛心樸子中克隆出CKEDS1,該基因在根和莖中表達量高,受SA誘導表達。將CkEDS1與GFP熒光蛋白構建出融合表達載體,其表達定位于細胞核。將CkEDS1轉入擬南芥野生型與edS1突變體細胞中,對轉基因株系在棉花黃萎病菌侵染下抗病情況分析,發(fā)現(xiàn)在21dpi時轉CkEDS1基因株系的病情指數(shù)分別為19.44和22.77低于野生型(36.11),而28dpi時轉CkEDS1基因株系的病情指數(shù)分別為42.78和42.22顯著低于野生型(72.78)�？共∠嚓P基因的表達水平分析表明,CkEDSl過表達株系中PR1、PR5和ICSl的表達量顯著高于野生型。轉CkEDS1基因棉花在田間表現(xiàn)出對黃萎病抗性。實驗驗證了CkEDS1能夠提高轉基因植物抗病能力。
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【學位授予單位】：中國農業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：Q943.2
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本文編號：1571643