本文關(guān)鍵詞： 性發(fā)育 定位克隆 miR-505-3p GT1-7 CRISPR/Cas9敲除小鼠　出處：《東華大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：近年來,隨著生活水平的不斷提高,性早熟兒童的發(fā)病率逐年上升,因此對性發(fā)育啟動調(diào)控機制的研究越發(fā)受到關(guān)注。性發(fā)育是個體成熟并獲得生殖能力的過程。作為一個復(fù)雜性狀,性發(fā)育的啟動受到遺傳和環(huán)境等多種因素的影響。在哺乳動物體內(nèi),性發(fā)育啟動受到下丘腦-垂體-性腺軸(HPG軸)的調(diào)控,其所分泌的各種激素水平可以直接調(diào)控性發(fā)育啟動并維持機體的生殖功能。在性發(fā)育前,HPG軸被抑制,各項激素分泌較少,因此不足以支持性腺的發(fā)育和性激素的合成。下丘腦GnRH神經(jīng)元是性發(fā)育啟動的關(guān)鍵,它可以以脈沖的形式分泌促性腺激素釋放激素(GnRH)。當性發(fā)育啟動時,GnRH神經(jīng)元分泌GnRH的頻率和脈沖幅度都顯著提高,因此這一現(xiàn)象成為性發(fā)育啟動的標志性事件。隨著對性發(fā)育啟動調(diào)控機制研究的不斷深入,有許多調(diào)控性發(fā)育啟動的關(guān)鍵基因被發(fā)現(xiàn),比如GnRH、Kiss1、GPR54等,但是沒有一個基因處于性發(fā)育過程的核心地位,可以對整個性發(fā)育過程負責。由于性發(fā)育的過程涉及多種細胞類型、細胞內(nèi)和細胞間的信號分子,因此性發(fā)育過程是由一個高度協(xié)調(diào)互作的基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的。目前,通過系統(tǒng)生物學(xué)研究,至少有三個功能相關(guān)的基因網(wǎng)絡(luò)被發(fā)現(xiàn),第一個基因網(wǎng)絡(luò)以腫瘤相關(guān)基因為核心,第二個和第三個基因網(wǎng)絡(luò)分別以lin28b和鋅指蛋白基因為核心。基因網(wǎng)絡(luò)之間還可以通過表觀遺傳學(xué)的方式進行動態(tài)調(diào)控。值得注意的是,性發(fā)育調(diào)控基因網(wǎng)絡(luò)中的基因都是一些轉(zhuǎn)錄/轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子。微小rna(mirna)作為一個重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子,它可以在多個層面調(diào)節(jié)基因的表達。目前已經(jīng)有研究提示mirnas也可以參與性發(fā)育啟動的調(diào)控。在本研究中,我們通過定位克隆的方式在x染色體上發(fā)現(xiàn)了參與調(diào)控性發(fā)育啟動的新基因在:mir-505-3p,并在細胞模型和動物模型中驗證了其對雌性小鼠性發(fā)育啟動的抑制功能。從2008年起,本實驗室利用性發(fā)育啟動時間有顯著差異的兩種近交系小鼠c3h/hej(c3)和c57bl/6j(b6)進行性發(fā)育相關(guān)基因的研究。我們首先建立c3和b6小鼠的雜交f2代,并對具有極端表型的f2代個體進行全基因組str掃描和遺傳分析。我們在6號、13號和x染色體上發(fā)現(xiàn)了與雌鼠陰門開啟(vaginalopening,vo)時間顯著相關(guān)的數(shù)量性狀基因座(qtl)。其中位于x染色體上(dxmit103~dxmit119)約25cm的性發(fā)育相關(guān)qtl首次被發(fā)現(xiàn),結(jié)果已在plosone發(fā)表。為了找到該qtl中調(diào)控性發(fā)育啟動的功能基因,我們利用特異區(qū)段染色體替換的方法構(gòu)建同類系,對該qtl進行精細定位。通過不斷與c3小鼠回交,我們在回交第7代(n7)中構(gòu)建了8個同類系,并通過對其表型和基因型的分析成功的將qtl精細定位在位于x染色體rs13483770~rs2905584間約1cm的區(qū)段內(nèi)。本研究從n7代中篩選出在rs13483770~rs29055848區(qū)段內(nèi)為b6基因型的個體,將篩選出來的個體與c3純系小鼠連續(xù)回交,直到n10代。在n10代中挑選出基因型為xbxc(表示該雌鼠的兩條x染色體一條來自于c3,一條在qtl區(qū)段來自于b6)的雌性小鼠,基因型為xby(表示該雄鼠的x染色體qtl區(qū)段來自于b6)和xcy(表示該雄鼠的x染色體來自于c3)的雄性小鼠,分別以xbxc×xcy和xbxc×xby的方式進行雜交,產(chǎn)生的后代為n11代。n11代中的雌鼠有三種基因型,分別是xbxb、xbxc和xcxc。通過比較這三種基因型雌鼠的性發(fā)育啟動時間,我們在n11代中再次確定該qtl會推遲雌性小鼠性發(fā)育啟動的這一表型。為了找到該qtl中的功能基因,我們對qtl中的7個蛋白編碼基因和一個mirnas基因進行了dna水平和表達量水平的研究。研究發(fā)現(xiàn),在性發(fā)育啟動前,mir-505-3p在b6小鼠下丘腦中的表達量要顯著高于c3,而其他的基因在b6和c3兩個品系中的表達并無差異。因此我們初步認為,在x染色體性發(fā)育相關(guān)qtl中對性發(fā)育啟動起到抑制作用的基因是mir-505-3p。為了進一步確認mir-505-3p對性發(fā)育啟動的抑制作用,我們分別在細胞水平和整體動物水平對mir-505-3p的基因功能加以驗證。在細胞水平,我們選擇永生化的gnrh神經(jīng)元gt1-7為細胞模型,并以慢病毒轉(zhuǎn)染的方式在gt1-7細胞中穩(wěn)定過表達mir-505-3p。我們發(fā)現(xiàn),當mir-505-3p的表達量增加時,在gt1-7細胞中調(diào)控性發(fā)育啟動的關(guān)鍵基因例如:gnrh、gpr54、kiss1的表達量顯著下降。這說明在該細胞模型中mir-505-3p確實對性發(fā)育啟動的相關(guān)基因產(chǎn)生抑制作用。接著為了進一步解析mir-505-3p的作用機制,通過對過表達mir-505-3p的細胞模型進行表達譜的分析發(fā)現(xiàn),過表達mir-505-3p會使gt1-7細胞中1490個基因的表達量產(chǎn)生2倍以上的表達量變化。對這些差異表達基因進行g(shù)o分析和kegg分析后發(fā)現(xiàn),過表達mir-505-3p可以使gnrh信號通路受到抑制。為了確定mir-505-3p的靶基因,我們用targetscan對mir-505-3p的靶基因進行了預(yù)測并對在gt1-7中高表達的靶基因進行了實驗驗證。其中靶基因srsf1由于其可以激活調(diào)控性發(fā)育啟動的關(guān)鍵信號通路,例如mtor信號通路而引起我們的關(guān)注。我們在穩(wěn)定表達mir-505-3p的gt1-7細胞中過表達srsf1后發(fā)現(xiàn),原本受到抑制的gnrh、kiss1等性發(fā)育調(diào)控關(guān)鍵基因的表達量回復(fù)。因此我們認為,mir-505-3p可以通過抑制srsf1的表達來抑制性發(fā)育啟動關(guān)鍵基因。同時我們在動物水平驗證了mir-505-3p對性發(fā)育啟動的調(diào)控作用。我們用crispr/cas9的方法成功的構(gòu)建了mir-505-3p基因敲除小鼠,并在敲除小鼠中對性發(fā)育啟動的相關(guān)表型進行了研究。我們發(fā)現(xiàn),相對于野生型b6小鼠而言,敲除mir-505-3p的小鼠性發(fā)育啟動時間顯著提前;其雌鼠的體重和性腺重量也顯著高于野生型小鼠。另外,敲除小鼠的生殖力也受到了影響,對p45的敲除小鼠進行卵巢切片后發(fā)現(xiàn),敲除小鼠卵巢中的黃體個數(shù)要顯著多于野生型小鼠;而且敲除小鼠表現(xiàn)出較高的難產(chǎn)率和出生后死亡現(xiàn)象。接著我們對敲除小鼠下丘腦中性發(fā)育相關(guān)基因的表達量進行了檢測,我們發(fā)現(xiàn)敲除mir-505-3p后,小鼠下丘腦中的srsf1、gnrh、kiss1、gpr54等基因的表達顯著提高;除此之外,敲除小鼠血清中的kisspepetin的濃度也顯著高于野生型小鼠。實驗結(jié)果顯示,在小鼠中mir-505-3p可能通過抑制Srsf1來抑制小鼠性發(fā)育啟動,但其背后的機制仍需要進一步的研究。除了miR-505-3p以外,我們還對性發(fā)育前后小鼠下丘腦中miRNAs的表達模式進行研究,找到了一組可能參與了性發(fā)育啟動的miRNAs。另外,本研究還對miRNAs的檢測方法和Cripsr/Cas9小鼠的分型方法進行了優(yōu)化。綜上所述,本研究從定位克隆出發(fā),找到了調(diào)控性發(fā)育啟動的新基因:miR-505-3p。無論在細胞水平還是整體動物水平,miR-505-3p都會對性發(fā)育的啟動產(chǎn)生抑制作用。這些研究使我們對性發(fā)育啟動的機制和微小RNA的功能的認知更進一步。
[Abstract]:In recent years , with the increasing living standards , the incidence of sexual development is increasing year by year . The development of sexual development is the key to the development of sexual development . In order to further confirm the inhibitory effect of mir - 505 - p on sexual development , we found that the expression of mir - 505 - 3P in the hypothalamus of mice was significantly higher than that of the female mice . In order to further confirm the effect mechanism of mir - 505 - 3P , we found that the expression of mir - 505 - 3P was inhibited in gt1 - 7 cells . In addition , this study has been optimized for the detection methods and the typing methods of Cripsr / Cas9 mice . In conclusion , the study has found a new gene for regulatory development : miR - 505 - 3P , both at cell level and at the whole animal level . These studies further enhance the cognitive development of the mechanism of sexual development initiation and the function of microRNA .

【學(xué)位授予單位】：東華大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：Q492

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本文編號：1542029