本文關(guān)鍵詞： 多聚半乳糖醛酸酶 熱穩(wěn)定性 T3 loop區(qū) 催化效率 分子動力學(xué)模擬　出處：《中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：果膠是一種帶負電荷的復(fù)雜高分子量多糖,主要存在于陸生植物的細胞壁中,占植物干重的三分之一。它主要由不同甲酯化程度的半乳糖醛酸以α-1,4糖苷鍵共價連接而成。由于果膠多糖的復(fù)雜性,其降解需要多種果膠酶共同作用,包括多聚半乳糖醛酸酶、果膠酸裂解酶、鼠李糖聚半乳糖醛酸酶、果膠甲酯酶和果膠乙酰酯酶等。果膠酶廣泛應(yīng)用于果汁、造紙、紡織工業(yè)以及油脂的提取工業(yè)。其中,研究最多、應(yīng)用最廣泛的果膠酶是多聚半乳糖醛酸酶。因此,探究多聚半乳糖醛酸酶結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系對于揭示其催化機理是非常重要的。本論文從嗜熱真菌Achaetomium sp.Xz8中克隆了一個內(nèi)切多聚半乳糖醛酸酶的編碼基因PG8fn,并在畢赤酵母中實現(xiàn)異源表達。與其他同類酶相比,重組PG8fn的高比活尤其突出:以多聚半乳糖醛酸為底物時的比活高達28,122 U/mg,是研究多聚半乳糖醛酸酶分子催化機制的理想材料。將PG8fn的晶體結(jié)構(gòu)進行解析,本文主要對其結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系展開研究。基于理性設(shè)計的思路探索在酶活不損失的前提下提高酶熱穩(wěn)定性的方法;通過系統(tǒng)研究活性T3 loop區(qū)上底物結(jié)合位點、二級結(jié)合位點和非活性位點對酶催化效率的影響,揭示活性loop區(qū)在酶催化過程中的作用;以PG8fn T3 loop區(qū)的結(jié)構(gòu)特征指導(dǎo)同類酶分子改良�；诘鞍妆砻骐姾煞植純�(yōu)化的理性設(shè)計方法對PG8fn進行熱穩(wěn)定性改良。通過酶熱穩(wěn)定性系統(tǒng)(ETSS)的計算結(jié)果,確定了可能與熱穩(wěn)定性相關(guān)的兩個位點Asp267和Asp322。構(gòu)建單點突變體(D267A和D322R)和組合突變體(D267A/D322R)進行表達和性質(zhì)測定,并與野生酶PG8fn進行比較。三個突變體的熱穩(wěn)定性都有所提高,提高幅度為D267A/D322RD322RD267A。組合突變體D267A/D322R較野生酶PG8fn的Tmax、T50和Tm值分別提高了10°C、17°C和10.2°C,在50°C和55°C下半衰期分別延長8.4 h和45 min,而其催化活力與野生酶保持在相當?shù)乃?23,000±130 U/mg和28,000±293 U/mg)。分子動力學(xué)模擬結(jié)果顯示突變位點Asp267和Asp322可以降低蛋白整體的RMSD值從而導(dǎo)致剛性增強。此研究結(jié)果揭示了表面電荷對蛋白構(gòu)象穩(wěn)定的重要性,并為蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性改造提供了一個極為有效的策略。該方法最突出的特點為提高酶熱穩(wěn)定性的同時不影響酶的催化活性。結(jié)構(gòu)分析顯示PG8fn的活性T3 loop區(qū)上保守殘基Asn117與底物形成氫鍵,本試驗探究了該殘基對酶催化效率的影響。分子動力學(xué)模擬分析表明虛擬突變體N117A缺失了117位殘基與底物+1位GalpA O3原子之間的氫鍵而使得底物與活性中心分離,而虛擬突變體N117Q具有更長的氨基酸側(cè)鏈,導(dǎo)致酶與底物錯誤結(jié)合而導(dǎo)致底物逐漸遠離活性中心。定點突變試驗結(jié)果與計算機模擬結(jié)果一致,即該位點對其他氨基酸特別敏感。除了Km值從野生酶PG8fn的0.32增加到0.75 4.74 mg/mL外,所有突變體的kcat下降了3 20,000倍,催化效率下降了8 187,500倍,從而導(dǎo)致△(△G)增加了5.92 33.47 kJ/mol。本試驗驗證了GH28多聚半乳糖醛酸酶活性T3 loop區(qū)通過殘基Asn117參與了酶的催化過程,該保守殘基Asn117對底物的正確定位使其靠近催化殘基具有重要的作用。PG8fn與已報道晶體結(jié)構(gòu)的Colletotrichum lupini多聚半乳糖醛酸酶CluPG1(PDB:2IQ7)序列一致性為79.6%,但比活差異一倍。通過結(jié)構(gòu)比對發(fā)現(xiàn)兩個酶催化口袋里的氨基酸高度相似,只有三個氨基酸殘基差異,其中兩個分別位于遠離催化位點的N末端和C末端,另外一個在PG8fn T3 loop區(qū)上的殘基Lys121,對應(yīng)CluPG1的Thr。將CluPG1上Thr121突變成Lys后,突變體T121K與底物親和力增大,比活提高到了22,300 U/mg,幾乎達到了PG8fn的水平,因此殘基Lys121是決定PG8fn具有高比活的關(guān)鍵位點。我們對其進行飽和突變研究,各突變體的Km值和kcat值差異顯著,其中,突變體K121F和K121W的Km值較野生酶PG8fn降低,催化效率較野生酶PG8fn分別提高了44%和105%。分子動力學(xué)模擬結(jié)果顯示,位于T3 loop區(qū)上的第121位殘基不僅影響了酶與底物的結(jié)合模式,還直接與底物的-4位GalpA相互作用,屬于多聚半乳糖醛酸酶的底物二級結(jié)合位點。此研究揭示了PG8fn較同類酶比活高的其中一個原因是活性T3 loop區(qū)上存在底物二級結(jié)合位點。在確定了活性T3 loop區(qū)對酶催化效率的重要影響后,進一步研究了T3 loop區(qū)上非活性位點在催化過程中的作用。根據(jù)PG8fn中獨特氨基酸組份分析以及靜態(tài)結(jié)構(gòu)的通道識別,確定了位于T3 loop區(qū)上靠近通道T1的殘基Thr113作為定點突變位點。突變試驗結(jié)果顯示各個酶催化效率從大到小的順序與113位點的氨基酸側(cè)鏈性質(zhì)相關(guān),即帶正電荷氨基酸(Arg、Lys)極性氨基酸(Ser、Gln、Thr)非極性氨基酸(Gly、Ala、Ile)帶負電荷氨基酸(Glu)。通道分析顯示突變體T113R較野生酶PG8fn通道T2和T3的占據(jù)率和優(yōu)先權(quán)更高。分子動力學(xué)模擬結(jié)果表明突變體T113R T3loop區(qū)由于鹽鍵的斷裂而導(dǎo)致柔性增加,繼而影響了酶與底物的結(jié)合。除此之外,殘基Arg113對催化效率的影響在另一個多聚半乳糖醛酸酶PG63上得到驗證。此研究證實了活性T3 loop區(qū)上的非活性位點可通過改變loop區(qū)柔性變化而影響酶催化效率,PG8fn較同類酶比活高的第二個原因是活性T3 loop區(qū)上存在極性氨基酸的非活性位點�；赑G8fn T3 loop區(qū)上成對的陽離子-π相互作用力這一結(jié)構(gòu)特征,指導(dǎo)PG63進行分子改良,并系統(tǒng)研究了陽離子-π相互作用力影響催化效率的分子機理。通過對PG63序列和結(jié)構(gòu)分析結(jié)合分子動力學(xué)模擬軌跡的陽離子-π相互作用力占有率計算結(jié)果,確定8個可能在PG63中形成陽離子-π相互作用力的位點。其中,引入成對的陽離子-π相互作用力的突變體H58Y較野生酶PG63的催化效率和Tm值分別提高144倍和3.9°C。分子動力學(xué)模擬結(jié)果表明位于突變體H58Y T3loop區(qū)上成對的陽離子-π相互作用力(Arg89-Trp90/Arg89-Tyr58)增加了鄰近的T3 loop2上保守殘基His158的剛性,從而很好的指引長鏈寡糖不斷的向催化口袋里傳送,增加反應(yīng)速率和轉(zhuǎn)換數(shù),從而提高催化效率。此研究證實了活性T3 loop區(qū)上成對的陽離子-π相互作用力可通過增加鄰近loop區(qū)上保守殘基His158的剛性而影響酶催化效率,同時,也從側(cè)面證實了PG8fn較同類酶比活高的第三個原因是活性T3 loop區(qū)上存在成對的陽離子-π相互作用力。本論文以高比活多聚半乳糖醛酸酶PG8fn為研究對象,通過對蛋白表面電荷分布的優(yōu)化,在酶活無損失的前提下有效提高了PG8fn的熱穩(wěn)定性,為酶熱穩(wěn)定性改造提供了一種有效策略;系統(tǒng)研究了活性T3 loop區(qū)上底物結(jié)合位點、二級結(jié)合位點、非活性位點和陽離子-π相互作用力對酶催化效率的影響,揭示了PG8fn具有高比活的分子機制,為活性loop區(qū)在酶催化反應(yīng)過程中的功能研究提供了新的視角,具有重要的科學(xué)意義和應(yīng)用價值。
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【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：Q55
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本文編號：1502723