本文關(guān)鍵詞： 蛋白質(zhì)內(nèi)含子 蛋白質(zhì)剪接 蛋白質(zhì)斷裂 脯氨酸 外顯子序列 定向進(jìn)化 雙純化 蓖麻毒蛋白 滌綸織物 抗靜電　出處：《東華大學(xué)》2016年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：蛋白質(zhì)內(nèi)含子(intein)是存在于前體蛋白中的一段氨基酸序列,它能夠發(fā)生自我剪切,并通過(guò)肽鍵將兩端的蛋白質(zhì)外顯子(N端外顯子N-extein,C端外顯子C-extein)連接起來(lái),形成成熟蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)內(nèi)含子根據(jù)結(jié)構(gòu)特征可以分為三類(lèi),標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)內(nèi)含子(canonical intein),微小蛋白質(zhì)內(nèi)含子(mini intein)和斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子(split intein)。其中,前兩種蛋白質(zhì)內(nèi)含子介導(dǎo)蛋白質(zhì)順式剪接(protein cis-splicing),斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子被斷裂成兩部分,N端蛋白質(zhì)內(nèi)含子(IN,N-intein)和C端蛋白質(zhì)內(nèi)含子(IC,C-intein),分別位于兩個(gè)閱讀框架中,介導(dǎo)蛋白質(zhì)反式剪接(protein trans-splicing)。蛋白質(zhì)內(nèi)含子在蛋白質(zhì)研究、蛋白質(zhì)工程及其它領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用,例如,蛋白質(zhì)內(nèi)含子已應(yīng)用于毒素蛋白的合成,目的蛋白的活性控制,基因治療,蛋白質(zhì)修飾、標(biāo)記,蛋白質(zhì)環(huán)化,蛋白質(zhì)純化等方面。本論文主要涉及蛋白質(zhì)內(nèi)含子通用性研究及應(yīng)用。前四部分為蛋白質(zhì)內(nèi)含子通用性研究,后三部分為應(yīng)用。分別為,蛋白質(zhì)內(nèi)含子Ssp Dna X在臨近外顯子中存在脯氨酸時(shí)的剪接研究;蛋白質(zhì)內(nèi)含子Ssp Dna X在剪接困難序列(KSCDKTH)中的剪接研究;定向進(jìn)化提高蛋白質(zhì)內(nèi)含子Ter Thy X剪接活性的研究;進(jìn)化前后蛋白質(zhì)內(nèi)含子Cne PRP8-S0及Cne PRP8-E-S0的比較研究;基于兩個(gè)純化標(biāo)簽的雙純化系統(tǒng)的應(yīng)用;蛋白質(zhì)內(nèi)含子剪接蓖麻毒蛋白的應(yīng)用;蛋白質(zhì)內(nèi)含子對(duì)滌綸織物抗靜電整理的應(yīng)用。本論文主要研究?jī)?nèi)容包括:1.在pMST系統(tǒng)中篩選三個(gè)剪接活性高的微小蛋白質(zhì)內(nèi)含子Ssp Dna X,Ter Dna E-3和Npu Dna E,將+2位突變?yōu)楦彼峄蛘邔?1位和+2位同時(shí)突變?yōu)楦彼?檢測(cè)蛋白質(zhì)內(nèi)含子的剪接活性。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),Ssp Dna X微小蛋白質(zhì)內(nèi)含子的剪接效率為100%。進(jìn)一步將Ssp Dna X斷裂成不同的斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子(S0,S1,S11),在體內(nèi)(in vivo)和體外(in vitro)檢測(cè)其剪接活性。當(dāng)+2位或-1位和+2位同時(shí)為脯氨酸時(shí),Ssp Dna X-S1/S11斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子在體內(nèi)外都能夠發(fā)生高效剪接。本文首次發(fā)現(xiàn),當(dāng)臨近外顯子中有脯氨酸時(shí),Ssp Dna X的微小蛋白質(zhì)內(nèi)含子和S1/S11斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子能夠高效剪接,這項(xiàng)發(fā)現(xiàn)使得蛋白質(zhì)內(nèi)含子的剪接不再受到脯氨酸的限制,可以將蛋白質(zhì)內(nèi)含子應(yīng)用于含有脯氨酸的宿主蛋白中,同時(shí)為Ssp Dna X三維結(jié)構(gòu)的研究提供了有用信息。2.將pMST中蛋白質(zhì)內(nèi)含子插入位點(diǎn)處的外顯子突變?yōu)镵SCDKTH序列,選用具有高剪接活性的斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子Ssp Dna X-S0/S1/S11和Ter Thy X-S0/S1/S11在pMST系統(tǒng)中嘗試剪接。研究結(jié)果表明,Ssp Dna X-S0/S1/S11在體內(nèi)外都有很高的剪接效率(~100%)。這一發(fā)現(xiàn)使蛋白質(zhì)內(nèi)含子的應(yīng)用不再受KSCDKTH序列的限制,也為抗體的剪接合成提供可行性基礎(chǔ)。3.在pKH系統(tǒng)中(卡那霉素抗性系統(tǒng)),通過(guò)定向進(jìn)化將Ter Thy X微小蛋白質(zhì)內(nèi)含子的剪接活性提高到~100%,而且在三個(gè)位點(diǎn)都有100%剪接活性,說(shuō)明獲得的Ter Thy X不僅剪接活性提高,通用性也有所提高。定向進(jìn)化是一種提高蛋白質(zhì)內(nèi)含子活性的簡(jiǎn)便、有效的方法,通過(guò)簡(jiǎn)單的隨機(jī)突變及定向篩選獲得高效剪接及通用性高的蛋白質(zhì)內(nèi)含子,可以高效剪接含有不同外顯子序列的目的蛋白。同時(shí)可以通過(guò)DNA測(cè)序得知蛋白質(zhì)內(nèi)含子的突變氨基酸,將結(jié)果反饋到蛋白質(zhì)內(nèi)含子結(jié)構(gòu)與剪接活性關(guān)系的研究中。4.在pMST系統(tǒng)中,將定向進(jìn)化前后的S0型斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子Cne PRP8-S0(天然+1位為Ser)和Cne PRP8-E-S0(天然+1位為Ser)進(jìn)行剪接效率、剪接動(dòng)力學(xué)(+1位為Ser或Cys)以及N-cleavage和C-cleavage的比較研究。研究發(fā)現(xiàn),進(jìn)化后的Cne PRP8-E-S0比天然Cne PRP8-S0在剪接速率和剪接活性方面都更加優(yōu)越,尤其是將天然+1位Ser突變?yōu)镃ys時(shí),Cne PRP8-E-S0表現(xiàn)出更強(qiáng)的適應(yīng)性。天然Cne PRP8-S0和進(jìn)化后Cne PRP8-E-S0的N-cleavage差別不大,而對(duì)于C-cleavage效率和速率,Cne PRP8-E-S0更占優(yōu)勢(shì)。本文通過(guò)比較天然Cne PRP8-S0及進(jìn)化后Cne PRP8-E-S0,發(fā)現(xiàn)通過(guò)定向進(jìn)化可以獲得具有功能優(yōu)勢(shì)的蛋白質(zhì)內(nèi)含子,獲得的Cne PRP8-E-S0不僅可以剪接更多的目的蛋白,而且由于其高效的C-cleavage速率和效率,還可以應(yīng)用于蛋白質(zhì)內(nèi)含子斷裂反應(yīng)介導(dǎo)的蛋白質(zhì)純化中。此外,定向進(jìn)化獲得的Cne PRP8-E-S0比具有優(yōu)越性能的天然斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子Npu Dna E更具優(yōu)勢(shì)(Cne PRP8-E-S0在+1位突變?yōu)榉翘烊话被釙r(shí)仍可高效剪接,而Npu Dna E剪接活性降低)。5.本文設(shè)計(jì)了一個(gè)雙純化方法,將SUMO純化標(biāo)簽與Ssp Gyr B S11斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子聯(lián)用,構(gòu)建一個(gè)雙純化系統(tǒng)。雙純化系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)為,His6-SUMO標(biāo)簽位于目的蛋白質(zhì)的N端,Ssp Gyr B S11N-CBD標(biāo)簽位于目的蛋白的C端,目的蛋白在整個(gè)融合蛋白的中間位置。研究結(jié)果表明,通過(guò)對(duì)麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)和硫氧還蛋白(Trx)進(jìn)行雙純化,在6種誘導(dǎo)條件下,均得到了純度高的MBP(純度95%,2.5-5 mg/L)和Trx(純度95%,4-8 mg/L),而且電噴霧電離質(zhì)譜(ESI-MS)檢測(cè)雙純化得到的Trx蛋白分子量的結(jié)果表明,經(jīng)過(guò)雙純化的目的蛋白沒(méi)有末端缺失,也沒(méi)有標(biāo)簽殘留。通過(guò)雙純化系統(tǒng)可以純化得到高純度的目的蛋白,同時(shí)解決了目的蛋白末端缺失的問(wèn)題,用雙純化方法得到的蛋白質(zhì),可以應(yīng)用于對(duì)蛋白質(zhì)要求較高的研究中,例如,蛋白質(zhì)組學(xué)研究。同時(shí),雙純化系統(tǒng)的提出,也使蛋白質(zhì)純化方法上升到一個(gè)新高度,一次性解決目的蛋白純度及末端缺失的問(wèn)題。6.蛋白質(zhì)內(nèi)含子可以用于毒素蛋白的生產(chǎn),本研究分為兩部分。第一部分,改造Ricin A(突變氨基酸),使其為蛋白質(zhì)內(nèi)含子的高效剪接提供基礎(chǔ),并通過(guò)Ricin A蛋白量與毒性關(guān)系曲線(xiàn),檢測(cè)三種突變體是否仍然具有毒性。第二部分,在Ricin A中選取兩個(gè)不同插入位點(diǎn)site1,site2,不改變外顯子氨基酸殘基(即不改變Ricin A的氨基酸),檢測(cè)Cne PRP8E-S0斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子的剪接活性。研究結(jié)果,第一部分,獲得Ricin A蛋白量與毒性關(guān)系曲線(xiàn)圖以及改造后Ricin A毒性的檢測(cè)方法,經(jīng)檢測(cè),三個(gè)突變體都沒(méi)有失去毒性。第二部分,發(fā)現(xiàn)Cne PRP8E-S0在位點(diǎn)site2處有輕微剪接活性(~31%)。本研究為蛋白質(zhì)內(nèi)含子在體外高效剪接Ricin A提供了一定的基礎(chǔ),也證明利用蛋白質(zhì)內(nèi)含子剪接Ricin A實(shí)現(xiàn)特異性殺傷腫瘤細(xì)胞的可行性。7.蛋白質(zhì)內(nèi)含子用于滌綸織物抗靜電整理。滌綸織物由于其耐穿、易洗滌等優(yōu)良性能,被廣泛應(yīng)用于服裝等領(lǐng)域。但是其分子結(jié)構(gòu)中缺少親水基團(tuán),因而具有親水性差、易產(chǎn)生靜電等缺點(diǎn)。利用蛋白質(zhì)內(nèi)含子的反式剪接功能將麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)與硫氧還蛋白(Trx)剪接形成的親水性融合蛋白MT對(duì)滌綸織物進(jìn)行功能整理。附著在滌綸織物上的MT融合蛋白,其親水基團(tuán)暴露在織物表面,增強(qiáng)了織物的親水性能,使織物表面的電荷逸散,從而使其半衰期明顯降低,提高其抗靜電性能。本文為深入研究蛋白質(zhì)等天然生物資源對(duì)滌綸織物的天然蛋白化,進(jìn)一步開(kāi)發(fā)具有保健等新功能的滌綸織物面料奠定理論基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：東華大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：Q51;TS195.5

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本文編號(hào)：1480220