G-蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)是最大家族的膜蛋白,具有七次跨膜結(jié)構(gòu),調(diào)控著人體各種生命活動且與疾病密切相關,約有一半的藥物作用在GPCR上。但是至今B類GPCR非肽類激動劑藥物一個也沒有,這是由于B類GPCR與激動劑的復合晶體結(jié)構(gòu)的缺失,極大地限制了對B類GPCR結(jié)構(gòu)與功能關系及其在人類重大疾病中調(diào)控機制的認識。關于天然的多肽如何與B類GPCR的N端ECD和跨膜區(qū)域TMD進行結(jié)合從而激活受體這一問題也不清楚。為了探討B(tài)類GPCR的ECD和TMD如何與配體進行識別結(jié)合的作用機制,通過cAMP檢測不同的B類GPCR的TMD和全長的受體的激活效用。結(jié)果顯示不同的B類受體對ECD需求截然不同,一組以CRF1R,PACIR及PTHIR為代表,它們對ECD的要求是可以忽略的；相反另一組以GCGR和GLP-1R為代表,它們的活性嚴格依賴于他們的ECD。進一步用錨定在膜上的多肽與受體共轉(zhuǎn),也只能激活全長的GLP-1R或GCGR,不能激活TMD,進一步表明ECD在受體激活下游信號通路中的重要性。再次證實ECD對GLP-1R和GCGR激動效應是必需的。用配體受體融合蛋白進一步研究GCGR和GLP-1R激活時必需有ECD的機制。通過ECD和多肽上的點突變,發(fā)現(xiàn)GCGR的ECD與配體結(jié)合的3個重要位點,W36,D63,P86,突變后融合蛋白自身活性明顯下降,且外源的多肽也不能使其活性恢復,表明這些位點與多肽直接結(jié)合密切相關。此外ECD表面和多肽上的一些突變也能引起融合蛋白活性明顯降低,GLP-1R的融合蛋白中也得到了相似結(jié)果,提示我們ECD在GLP-1R和GCGR激活中不僅有親和多肽的作用,且與ECD有直接的結(jié)合作用。為研究2型糖尿病預防和治療的分子機制以及為新藥設計和研發(fā)提供實驗根據(jù),通過cAMP實驗表明GLP-1R的小分子激動劑Boc5、S4P、WB4-24不僅具有物種選擇性,直接結(jié)合ECD,且需要ECD才能激活GLP-1R下游信號通路。相反BETP不直接結(jié)合ECD,與第三個胞內(nèi)環(huán)的C347共價結(jié)合激活GLP-1R,但同樣需要ECD才能激活受體,提示我們ECD在GLP-1R激活效用中所起的直接作用。這些化合物的研究將為小分子與受體的相互作用機制提供新的思路,為設計新的小分子化和物治療糖尿病提供可能。GLP-1R是抗糖尿病相關的靶標蛋白,穩(wěn)定性差,導致全長的GLP-1R的結(jié)晶難度極大。在昆蟲細胞表達系統(tǒng)和哺乳細胞BacMam表達系統(tǒng)中通過基因改造、載體和純化條件優(yōu)化使其蛋白穩(wěn)定、利于結(jié)晶。得到了性狀較好的激活的融合蛋白,為結(jié)晶工作及解析配體與受體復合物激活構(gòu)象做好充分準備。將為B類GPCR激活狀態(tài)下配體與受體結(jié)合作用模式提供一個直接的構(gòu)象依據(jù),為2型糖尿病新藥開發(fā)提供結(jié)構(gòu)基礎,具有不可估量的應用價值。