本文關(guān)鍵詞：明永冰川及其退卻地區(qū)垂直氣候帶的細(xì)菌群落多樣性研究　出處：《昆明理工大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：位于滇西北的明永冰川屬梅里雪山山系,深處我國(guó)青藏高原東南部生物多樣性最為豐富的橫斷山區(qū),是我國(guó)獨(dú)有的低緯度、高海拔季風(fēng)性冰川,在水平距離不到15公里的范圍內(nèi),海拔垂直落差近5,000 m,其間無(wú)任何地理隔絕。在該分布區(qū)內(nèi),形成了完整的冰川-森林-干暖河谷垂直氣候帶,使得生物多樣性集中體現(xiàn)在一個(gè)非常狹窄的區(qū)域內(nèi)。本論文以明永冰川及其退卻地區(qū)垂直氣候帶的微生物生態(tài)分布為研究對(duì)象,重點(diǎn)對(duì)該地區(qū)細(xì)菌群落的組成和結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究。論文首先通過(guò)經(jīng)典微生物純培養(yǎng)方法,利用四種不同的培養(yǎng)基從明永冰川地區(qū)共分離得到37,513株細(xì)菌,根據(jù)菌落形態(tài)分為391株,分離到的絕大部分菌株能在4℃-37℃生長(zhǎng),少部分僅能在4℃-25℃生長(zhǎng)。研究結(jié)果表明,寡營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基PYGV分離得到的細(xì)菌種類多于LB和Organnic等富營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基,表明PYGV針對(duì)冰川地區(qū)細(xì)菌的分離與鑒定更為合適。對(duì)分離得到的部分菌株進(jìn)行了鑒定,結(jié)果表明分離到的菌株大部分為革蘭氏陰性菌,分布于4個(gè)菌門(變形菌門、放線菌門、厚壁菌門、擬桿菌門)、4個(gè)菌綱(丫-變形菌綱、放線菌綱、芽孢桿菌綱、黃桿菌綱)、7個(gè)菌目(假單胞菌目、腸桿菌目、黃胞單菌目、鏈霉菌亞目、微球菌亞目、芽孢桿菌目、黃桿菌目)、7個(gè)菌科(假單胞菌科、腸桿菌科、黃胞單菌科、鏈霉菌科、短桿菌科、芽孢桿菌科、黃桿菌科)和7個(gè)菌屬(假單胞菌屬(Pseudomonas)、耶爾森氏菌屬(Yersinia)、寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、短桿菌屬(Brevibacterium)、芽孢桿菌屬(Bacillus)和黃桿菌屬(Flavobacterium)),其中假單胞菌屬最多,在已鑒定過(guò)的細(xì)菌中占比超過(guò)35%,其余6個(gè)屬的細(xì)菌占比不到65%。最后,以分離的部分細(xì)菌為宿主對(duì)該地區(qū)可培養(yǎng)低溫噬菌體進(jìn)行了分離和性質(zhì)研究,共分離得到6株在4℃仍然可以生長(zhǎng)繁殖的低溫噬菌體,并對(duì)它們的性質(zhì)進(jìn)行了初步研究。為進(jìn)一步探討針對(duì)該地區(qū)低溫細(xì)菌更精細(xì)的分類鑒定方法,論文根據(jù)細(xì)胞膜質(zhì)組成受溫度影響顯著的特點(diǎn),利用來(lái)源于三個(gè)不同氣候帶的12株可培養(yǎng)低溫細(xì)菌,通過(guò)氣相色譜法分析了它們?cè)诘蜏嘏囵B(yǎng)條件下的膜不飽和脂肪酸組成情況,并以不飽和脂肪酸的組成對(duì)低溫菌做了聚類分析。研究結(jié)果表明,絕大部分的細(xì)菌分類結(jié)果與16S rRNA基因構(gòu)建的進(jìn)化關(guān)系一致,證明利用膜不飽和脂肪酸組成能對(duì)該地區(qū)的低溫細(xì)菌進(jìn)行科學(xué)的分類。同時(shí)在研究中發(fā)現(xiàn)部分細(xì)菌利用新方法能得到比16S rRNA基因分析法更精細(xì)的分類地位,證明以膜質(zhì)脂肪酸組成進(jìn)行分類鑒定能更好的區(qū)分同一種屬的低溫細(xì)菌在親緣關(guān)系上的遠(yuǎn)近。研究結(jié)果也同時(shí)證明了經(jīng)過(guò)選擇的這些低溫細(xì)菌細(xì)胞膜中的不飽和脂肪酸的比例與溫度成反比關(guān)系,即溫度越低,不飽和脂肪酸的含量越大。雖然大部分不飽和脂肪酸成分與已報(bào)道過(guò)的其它低溫細(xì)菌大致相同,但部分低溫細(xì)菌的脂肪酸組分并不相同,這一現(xiàn)象值得在今后進(jìn)行進(jìn)一步研究。為更客觀和全面地了解明永冰川地區(qū)不同垂直氣候帶細(xì)菌群落的組成和結(jié)構(gòu),論文采用16S rRNA基因V6高變區(qū)測(cè)序技術(shù)對(duì)明永冰川十一個(gè)樣點(diǎn)的土壤樣品的免培養(yǎng)細(xì)菌進(jìn)行了檢測(cè)和分析。重點(diǎn)對(duì)分布于三個(gè)垂直氣候帶中的四個(gè)代表性樣品進(jìn)行了分析。研究表明：在4個(gè)樣品中共包含了21個(gè)菌門,42個(gè)菌綱,79個(gè)菌目,主要優(yōu)勢(shì)菌群包括Proteobacteria、Deinococcus-Thermus、Firmicutes、 Actinobacteria和Nitrospirae等5個(gè)菌門。其中Verrucomicrobia菌門為明永冰川獨(dú)有,尚未在其它冰川微生物的研究中報(bào)道過(guò)。對(duì)不同氣候帶細(xì)菌群落組成通過(guò)16S rRNA基因V6高變區(qū)測(cè)序技術(shù)的分析表明,不同氣候帶的細(xì)菌組成主要在菌目這一級(jí)別就有顯著差異,部分氣候帶的細(xì)菌群落組成甚至在菌門、菌綱這一級(jí)別都表現(xiàn)出明顯差異,充分說(shuō)明不同氣候帶細(xì)菌群落組成具有明顯的特征。在菌科、菌屬這一分類級(jí)別中,由于數(shù)量過(guò)于龐大反而難于歸納出各氣候帶的細(xì)菌群落組成特征。經(jīng)過(guò)對(duì)處于優(yōu)勢(shì)地位的細(xì)菌群落分析后證明：在菌屬這一級(jí)的分類中,棒狀桿菌屬(Corynebacteriu)、丙酸桿菌屬(Propionibacterium)和鏈球菌屬(Streptococcus)三個(gè)菌屬在各個(gè)氣候帶排名前十優(yōu)勢(shì)菌屬的組成上都有出現(xiàn),說(shuō)明它們?cè)谠摰貐^(qū)分布最為廣泛,與環(huán)境有較好的適應(yīng)性。假單胞桿菌屬(Pseudomonas)的細(xì)菌在所有樣品中都有分布,但在排名前十的優(yōu)勢(shì)菌屬中只有寒溫帶與接近寒帶的樣品中可以發(fā)現(xiàn)它們,初步表明此屬細(xì)菌在低溫的環(huán)境下能更好的生長(zhǎng),是該區(qū)域的優(yōu)勢(shì)種群之一,這一結(jié)果也間接印證了該地區(qū)可培養(yǎng)細(xì)菌分離的結(jié)果。在論文的最后,我們利用宏基因組測(cè)序的方法對(duì)位于中溫帶與寒帶之間的寒溫帶的土壤樣品進(jìn)行了分析,在16S rRNA基因V6高變區(qū)測(cè)序技術(shù)分析結(jié)果中,此氣候帶的細(xì)菌多樣性相對(duì)比較低,在優(yōu)勢(shì)細(xì)菌群落的組成上與相鄰的兩個(gè)氣候帶有較大不同。經(jīng)過(guò)對(duì)總量約30G的測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行整理分析后表明,僅針對(duì)細(xì)菌的物種注釋該區(qū)域就發(fā)現(xiàn)了44個(gè)菌門和49個(gè)菌綱,證明了明永冰川地區(qū)有豐富的細(xì)菌多樣性。經(jīng)過(guò)對(duì)16S rRNA基因V6高變區(qū)的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析,發(fā)現(xiàn)主要的優(yōu)勢(shì)菌群在門、綱和目級(jí)三個(gè)分類級(jí)別中排名前十的細(xì)菌中,分別有6個(gè)菌門、5個(gè)菌綱和3個(gè)菌目組成相同,但是在具體到每個(gè)優(yōu)勢(shì)菌群所占比例上又有所差異,而在科或科以下的分類級(jí)別中,兩種方法中排名前十的優(yōu)勢(shì)菌種幾乎沒(méi)有一致性。造成這一差異的原因可能存在以下幾個(gè)方面：首先由于16SrRNA基因測(cè)序分析法必須經(jīng)過(guò)一個(gè)PCR擴(kuò)增過(guò)程,而不同細(xì)菌模板DNA的擴(kuò)增倍數(shù)不一樣,最佳擴(kuò)增條件也可能不同；其次,兩種方法的物種注釋方法及數(shù)據(jù)庫(kù)存在有明顯的差別�？偟膩�(lái)看,宏基因組測(cè)序所達(dá)到注釋物種的覆蓋率要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于16S rRNA基因V6高變區(qū)測(cè)序法所能達(dá)到的覆蓋率。表明該方法對(duì)復(fù)雜生態(tài)環(huán)境中微生物群落研究具有更好的覆蓋率,有利于更完整地體現(xiàn)特定生態(tài)環(huán)境中微生物的組成情況,只是該方法目前費(fèi)用較高,從研究的經(jīng)濟(jì)性上有一定的限制。利用宏基因測(cè)序數(shù)據(jù)開(kāi)展的代謝途徑研究中我們發(fā)現(xiàn)本區(qū)域細(xì)菌中的熱點(diǎn)信號(hào)通路多集中在了環(huán)境信息加工、遺傳信息加工和新陳代謝三個(gè)方面；而在相關(guān)功能模塊的統(tǒng)計(jì)中,在已知的功能基因中,氨基酸的運(yùn)輸與代謝相關(guān)的基因、信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制相關(guān)的基因和能量的生產(chǎn)和轉(zhuǎn)變相關(guān)的基因排在前三位,這與信號(hào)通路中的熱點(diǎn)基本吻合。對(duì)比各種方法得到的結(jié)果,純培養(yǎng)方法在11個(gè)采樣點(diǎn)分離得到的全部細(xì)菌來(lái)自于4個(gè)菌門,4個(gè)菌綱；免培養(yǎng)法的16S rRNA基因V6高變區(qū)高通量的測(cè)序分析在4個(gè)采樣點(diǎn)得到的全部序列則來(lái)自于21個(gè)菌門,42個(gè)菌綱；宏基因組方法在一個(gè)采樣點(diǎn)得到44個(gè)菌門,49個(gè)菌綱。從以上結(jié)果我們不難看出幾種方法在研究細(xì)菌群落分布上各有各的特點(diǎn)：純培養(yǎng)方法主要針對(duì)可培養(yǎng)微生物,在得到基本細(xì)菌組成的同時(shí)可以得到一批珍貴的可培養(yǎng)細(xì)菌,但得到的細(xì)菌種類受分離條件的限制,種類較少；而基于16S rRNA基因V6高變區(qū)的高通量測(cè)序分析的免培養(yǎng)法針對(duì)細(xì)菌,可以較為迅速和經(jīng)濟(jì)地得到一個(gè)區(qū)域內(nèi)細(xì)菌種群的組成與結(jié)構(gòu)信息,但對(duì)該地區(qū)細(xì)菌相關(guān)代謝通路及功能基因則無(wú)法了解；而宏基因組學(xué)方法則可以較為詳細(xì)了解一個(gè)區(qū)域內(nèi)的物種組成、代謝通路和功能基因,而且該方法的物種注釋還可以擴(kuò)展到除細(xì)菌外的其它微生物種群,有利于更全面地了解特定環(huán)境中所有生物群落的組成,但該方法依然受到檢測(cè)價(jià)格高、樣品總DNA的提取方法、測(cè)序手段的限制,而在得到海量數(shù)據(jù)后還受到生物信息分析技術(shù)、樣品復(fù)雜度和測(cè)序深度的影響,當(dāng)然隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步,我們相信宏基因組分析方法將是未來(lái)進(jìn)行環(huán)境群落和代謝分析的重要手段。論文通過(guò)純培養(yǎng)、免培養(yǎng)方法、膜不飽和脂肪酸組分分析法以及宏基因組等方法,對(duì)明永冰川不同氣候帶的細(xì)菌群落分布等進(jìn)行了系統(tǒng)地調(diào)查和分析。首次從不同角度和尺度對(duì)低緯度、高海拔的明永冰川地區(qū)的細(xì)菌群落組成及多樣性進(jìn)行了調(diào)查,并對(duì)各個(gè)不同的垂直氣候帶之間的細(xì)菌群落的分布使用多種方法進(jìn)行了綜合研究。是從宏觀到微觀的一次系統(tǒng)性調(diào)查和資源收集,使得這一獨(dú)特地理環(huán)境的微生物生態(tài)研究更加系統(tǒng)化。論文首次利用氣相色譜法,根據(jù)膜不飽和脂肪酸組成的不同對(duì)該地區(qū)分離得到的12株低溫細(xì)菌開(kāi)展了分類學(xué)方法的研究,結(jié)果表明該方法的結(jié)果不僅與基于16S rRNA基因序列分析得到的結(jié)果一致,而且相比后者更為精細(xì),是對(duì)該地區(qū)微生物尤其是低溫細(xì)菌進(jìn)行分類的一種重要方法,該方法也可望用于其它地區(qū)低溫細(xì)菌的精細(xì)分類。研究中還分離得到了一批可培養(yǎng)的低溫噬菌體及其宿主菌,積累了大量的微生物資源,為今后在實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)一步開(kāi)展噬菌體的低溫適應(yīng)性機(jī)制、噬菌體與宿主的相互作用及噬菌體與宿主的協(xié)同進(jìn)化機(jī)制等研究提供了珍貴的實(shí)驗(yàn)材料。本研究的結(jié)果不僅使得這一獨(dú)特地理環(huán)境地區(qū)的微生物生態(tài)研究更加系統(tǒng)化,也為進(jìn)一步在該地區(qū)開(kāi)展生物地球化學(xué)、微生物生態(tài)學(xué)及挖掘微生物資源奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:Located in the northwest of Yunnan Mingyong Glacier belongs to the Meili Xue Shan mountains, the depths of our country southeast of the Tibetan Plateau biodiversity is most abundant in the Hengduan Mountains, is China's unique low latitude and high altitude monsoon glaciers, horizontal distance in the range of less than 15 kilometers, the elevation drop of nearly 5000 m, there is no any geography isolated. In the distribution area, the formation of a complete glacier - Forest - dry warm valley vertical climatic zones, the biodiversity is reflected in a very narrow range. In this paper, Mingyong Glacier and retreat area vertical climatic zones of microbial ecological distribution as the research object, the composition and structure of bacteria community in the region was studied. Firstly, through the method of classic pure culture microorganisms, using four different kinds of culture medium from Mingyong Glacier area 37513 bacteria strains were isolated, divided into 391 strains according to the colony morphology, 鍒嗙鍒扮殑緇濆ぇ閮ㄥ垎鑿屾牚鑳藉湪4鈩，

本文編號(hào)：1368332