本文關(guān)鍵詞：化學(xué)小分子誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)活性中心周圍微環(huán)境的變化　出處：《南京師范大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ),一切生命活動離不開蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)在生命體內(nèi)的活性和功能取決于其結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)象。由于蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)主要依靠氫鍵、范德華力、靜電力等非共價作用的共同平衡而維持,但這些作用力較弱且易受溫度、酸堿度、壓力、離子強度、外源性分子作用等因素影響而發(fā)生改變,導(dǎo)致蛋白質(zhì)構(gòu)象和功能發(fā)生改變,甚至導(dǎo)致某些疾病的產(chǎn)生。與蛋白質(zhì)結(jié)合的某些化學(xué)小分子,包括藥物分子對蛋白質(zhì)維持結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定性具有極其重要的作用。因此,研究化學(xué)小分子與蛋白質(zhì)相互作用機理和規(guī)律,有助于深入了解蛋白質(zhì)構(gòu)象與功能的關(guān)系,解釋外源性分子在生物體內(nèi)的結(jié)合、運輸過程,也有助于在分子水平上解釋某些疾病的致病機制,為某些復(fù)雜疾病的基礎(chǔ)研究和防治等提供重要的理論指導(dǎo)。本論文研究了化學(xué)小分子與蛋白質(zhì)的相互作用機理,及作用后蛋白質(zhì)活性中心周圍微環(huán)境的變化。以葡萄糖氧化酶、人血清白蛋白和肌紅蛋白為蛋白質(zhì)分子模型,利用電化學(xué)方法、多種光譜法如：紫外可見吸收光譜法、熒光光譜法(包括熒光淬滅法、同步熒光光譜法、熒光共振能量轉(zhuǎn)移法、時間分辨熒光光譜法)、紅外光譜法、圓二色譜法,以及分子模擬計算等,研究了溶液中有機小分子(以硫酸胍為例)、抗腫瘤藥物小分子(以5-氟尿嘧啶為例)、光敏劑(以酞菁鋅衍生物為例)和不同pH條件分別對以上蛋白質(zhì)進行誘導(dǎo)后蛋白質(zhì)發(fā)生的結(jié)構(gòu)變化機理,及誘導(dǎo)后蛋白質(zhì)活性中心周圍微環(huán)境的變化。本論文的主要內(nèi)容及結(jié)果如下：1.研究了有機小分子(以Gdm+為代表)誘導(dǎo)蛋白質(zhì)(以葡萄糖氧化酶(GOx)為模型)結(jié)構(gòu)及其活性中心周圍微環(huán)境變化的機制。利用電化學(xué)方法,研究了不同濃度Gdm+誘導(dǎo)后對GOx的電催化活性與其構(gòu)象的關(guān)系。結(jié)合紫外-可見吸收光譜法、紅外光譜法、圓二色譜法及分子模擬計算等方法深入研究了Gdm+誘導(dǎo)的GOx結(jié)構(gòu)與其催化性能的關(guān)系。結(jié)果表明,Gdm+與GOx作用時能進入其疏水腔使GOx發(fā)生去折疊過程,GOx的a-螺旋結(jié)構(gòu)含量減少,戶折疊結(jié)構(gòu)含量增加；分子模擬研究發(fā)現(xiàn)Gdm+與GOx的氧化還原活性中心FAD作用,使FAD分子本身的電子性質(zhì)、與周圍氨基酸殘基的氫鍵等發(fā)生了明顯改變,這是導(dǎo)致GOx的二級、三級結(jié)構(gòu)變化的決定性因素,也進一步使GOx對葡萄糖的催化氧化活性明顯降低。2.研究了抗腫瘤藥物小分子(以5-氟尿嘧啶(FU)為代表)與人血清白蛋白(HSA)的相互作用機理及FU-HSA結(jié)合位點微環(huán)境的變化。研究結(jié)果表明,FU分子能夠進入HSA分子中Trp 214殘基附近的ⅡA域,并與Trp 214和Lys 199殘基形成氫鍵,從而導(dǎo)致Trp 214殘基發(fā)生了靜態(tài)熒光淬滅。分子對接和熱力學(xué)參數(shù)分析的結(jié)果表明,HSA與FU的結(jié)合主要由范德華力和氫鍵驅(qū)動形成了FU-HSA復(fù)合物,從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)微環(huán)境比天然結(jié)構(gòu)更加疏水。此外,HSA與低濃度(150 μmol/L)時的FU作用使α-螺旋結(jié)構(gòu)含量增加,而與高濃度(150 μmol/L)的FU作用時則使α-螺旋結(jié)構(gòu)含量減少,這可能是由于蛋白質(zhì)在此作用過程中發(fā)生了一定程度的扭轉(zhuǎn)導(dǎo)致。3.研究了光敏劑(以酞菁鋅衍生物(ZnPcs:ZnPc1、ZnPc2、ZnPc3)為代表)人血清白蛋白(HSA)的相互作用及ⅡA域微環(huán)境變化的機制。研究結(jié)果表明,三種ZnPcs衍生物都進入了HSA分子中Trp 214殘基附近的ⅡA域內(nèi),且分別與HSA形成了ZnPcs衍生物-HSA復(fù)合物,使Trp214周圍環(huán)境更親水；作用過程中Trp214殘基發(fā)生了靜態(tài)熒光淬滅,并伴隨一定程度的動態(tài)淬滅過程；HSA與三種ZnPcs衍生物的結(jié)合主要通過靜電引力和疏水作用力形成了ZnPcs衍生物-HSA復(fù)合物,此外,與ZnPcl和ZnPc2相比,由于ZnPc3靜電勢較高,ZnPc3衍生物與HSA作用后使HSA的靜電荷分布變化最大,且ZnPc3使Trp214周圍殘基氫鍵的變化也最大,說明ZnPcs三種衍生物中,ZnPc3與HSA的作用最強。4.研究了不同pH環(huán)境誘導(dǎo)下肌紅蛋白(Mb)結(jié)構(gòu)及血紅素周圍微環(huán)境變化的機理,建立了一種檢測溶液中含血紅素蛋白結(jié)構(gòu)及其血紅素周圍微環(huán)境變化的簡單方法�；谘h(huán)伏安法測量Mb在不同pH緩沖溶液中的電子轉(zhuǎn)移信號能夠靈敏地反映出Mb分子的活性中心血紅素基團周圍結(jié)構(gòu)的微妙變化。在酸性和堿性溶液中,由于血紅素中Fe-His 93配位鍵斷裂,血紅素基團從Mb的疏水腔中分離而暴露于溶劑中,使Mb在溶液中的電子轉(zhuǎn)移信號增強。結(jié)合紫外可見光譜法、拉曼光譜法、CD光譜法和分子模擬計算研究了不同pH條件下Mb結(jié)構(gòu)和活性中心血紅素基團周圍微環(huán)境的變化,結(jié)論與電化學(xué)方法研究結(jié)論一致,說明電化學(xué)方法可用于檢測氧化還原蛋白Mb在溶液中的結(jié)構(gòu)變化,與其他方法相比,電化學(xué)方法具有反應(yīng)靈敏、操作簡便、成本低廉等優(yōu)點,并且該方法可以反映溶液中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化的動力學(xué)過程。
[Abstract]:Protein is the material basis of life, all life activities cannot do without protein. The activity and function of proteins in vivo depends on its structure and conformation. The protein structure mainly depends on the hydrogen bond, van Edward, common balance electric non covalent interactions and maintain, but these forces are weak and vulnerable temperature, pressure, pH, ionic strength, exogenous molecules and other factors change, leading to protein conformational and functional changes, and even cause some diseases. And the protein binding of certain chemical molecules, including plays an extremely important role in the stability of drug molecules to maintain protein structure and function. Therefore, study on chemical molecules and protein interaction mechanism and law, contribute to a deeper understanding of the relationship between protein conformation and function, explain the exogenous molecules in biological In combination, the transportation process, but also help in the molecular level to explain pathogenesis of some diseases, and provide important theoretical guidance for some complex diseases research and prevention. The interaction mechanism of the study of chemical molecules and proteins, and the role of protein changes around the active center of the micro environment. With glucose oxidase, human serum albumin and myoglobin protein molecular model, using electrochemical method, spectroscopic methods such as UV Vis absorption spectroscopy, fluorescence spectroscopy (including fluorescence quenching method, synchronous fluorescence spectroscopy, fluorescence resonance energy transfer assay, time-resolved fluorescence spectroscopy, infrared spectroscopy, circular) two chromatography and molecular simulation, studied organic molecules in solution (with guanidine sulfate as an example), small molecule drugs (5- fluorouracil for example), photosensitizer (in zinc phthalocyanine Derivatives as an example) and different pH conditions were changed after the induction of protein structure mechanism of protein, and protein induced changes around the active center of the microenvironment. The main contents and results of this thesis are as follows: 1. of small organic molecules (represented by Gdm+) induced protein (with glucose oxidase (GOx as the model mechanism of surrounding structures)) and the active center of micro environmental changes. Using the electrochemical method, the relationship between the electrocatalytic activity of GOx and the conformation of the effects of different concentrations of Gdm+. After induction with UV Vis absorption spectroscopy, infrared spectroscopy, the relationship between round two chromatography and molecular simulation calculation method research the structure and catalytic performance of GOx induced by Gdm+. The results showed that Gdm+ and GOx can enter the hydrophobic cavity of the GOx to reduce the content of the folding process, a- helix structure of GOx, the user node folding The content increased; molecular simulation study found that the oxidation of Gdm+ and GOx reduction activity center FAD, the electronic properties of FAD molecule itself, and the surrounding amino acid residues hydrogen changed obviously, which is the two level to GOx three level, the decisive factor of structural changes, but also further the catalytic oxidation activity of GOx on glucose significantly decreased the.2. of small molecule drugs (5- fluorouracil (FU) as the representative) and human serum albumin (HSA) change site micro environment with interaction mechanism and FU-HSA. The results show that the FU molecule can enter the domain near the molecule of HSA II A Trp 214 residues, and the formation of hydrogen bonds between Trp 214 and Lys 199 residues, resulting in Trp 214 residue static fluorescence quenching. Analysis of molecular docking and thermodynamic parameters showed that the combination of HSA and FU mainly by van Edward driving force and hydrogen bond formation The FU-HSA complex, which leads to the protein microenvironment more hydrophobic than natural structure. In addition, HSA with low concentration (150 mol/L) FU is the alpha helix content increased, and the high concentration (150 mol/L) FU is the alpha helix structure which can reduce the content. This is due to the protein effect in the process of the reverse occurs to a certain extent on the.3. (zinc phthalocyanine derivatives photosensitizer leads to (ZnPcs:ZnPc1, ZnPc2, ZnPc3) as the representative) human serum albumin (HSA) mechanism of interaction and domain II A microenvironment. The results showed that three kinds of ZnPcs derivatives into the II A domain near HSA molecule Trp 214 residues, and HSA respectively with the formation of ZnPcs derivatives of -HSA complexes, the Trp214 environment more hydrophilic; role in the process of Trp214 residue static fluorescence quenching and dynamic quenching, with a certain degree of death; The combination of HSA and three kinds of ZnPcs derivatives mainly by electrostatic force and hydrophobic force to form derivatives of ZnPcs -HSA complex, in addition, compared with ZnPcl and ZnPc2 ZnPc3, due to the electrostatic potential is high, ZnPc3 derivatives with HSA. After the HSA static charge distribution and the change of the biggest change, ZnPc3 Trp214 is also the largest hydrogen bonding residues around ZnPcs, three kinds of derivatives, ZnPc3 and HSA.4. had the strongest effect on different pH environment under the induction of myoglobin (Mb) mechanism and structure around the heme microenvironment change, a simple method of environment around the heme heme containing changes in protein structure and a detection solution. The cyclic voltammetry in electronic measurement Mb different pH buffer solution transfer signal can sensitively reflect subtle changes in structure around the active center of the heme group based on Mb molecule. In acidic and alkaline solution, The heme Fe-His 93 ligand bond cleavage, heme group separation and exposed to the solvent from the hydrophobic cavity of the Mb, the Mb signal of electron transfer in solution increased. Combined with ultraviolet visible spectroscopy, Raman spectroscopy, study the changes around different pH conditions Mb structure and active center of micro heme group the calculation of CD spectroscopy and molecular modeling, the research conclusion and electrochemical methods are consistent, the electrochemical method can be used to detect structural changes of redox protein Mb in solution, compared with other methods, the electrochemical method has sensitive reaction, simple operation, low cost, and the method can reflect the dynamic change process of protein structure in the solution.

【學(xué)位授予單位】：南京師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：Q51

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本文編號：1355782