本文關(guān)鍵詞：源自大腸桿菌的木糖：質(zhì)子同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的結(jié)構(gòu)與功能研究　出處：《清華大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

  更多相關(guān)文章： Xyl E MFS 膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 GLUT 轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)理

【摘要】：糖類代謝在新陳代謝等生命活動(dòng)中具有關(guān)鍵作用,其中又以葡萄糖代謝最為重要。糖類進(jìn)入細(xì)胞必須通過細(xì)胞膜上的糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。對(duì)葡萄糖來說,人體中有兩類轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,與多種生理病理活動(dòng)息息相關(guān)。本文選擇其中一類GLUT家族蛋白作為研究對(duì)象,借助其原核同源蛋白Xyl E來考察。Xyl E源自大腸桿菌,是底物專一的木糖:質(zhì)子同向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,與I型GLUT家族成員有接近50%的一級(jí)序列相似度。葡萄糖可以抑制Xyl E的轉(zhuǎn)運(yùn)功能,不能被Xyl E轉(zhuǎn)運(yùn);I型GLUT家族成員轉(zhuǎn)運(yùn)底物則不像Xyl E一樣需要質(zhì)子參與。因此Xyl E的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)理仍然和I型GLUT家族成員存在一定差異。為了深入理解這類糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的機(jī)理,我們以X射線晶體學(xué)的手段,解析得到了Xyl E分別與底物木糖、底物類似物葡萄糖及人工合成的葡萄糖溴代衍生物結(jié)合的結(jié)構(gòu),分辨率分別為2.8?、2.9?和2.6?。這三個(gè)Xyl E結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出經(jīng)典的12次跨膜α螺旋MFS折疊方式,但在胞內(nèi)區(qū)域多出一個(gè)四α螺旋的結(jié)構(gòu)域,且具有向細(xì)胞外側(cè)開放、部分封閉的全新構(gòu)象,完善了該家族結(jié)構(gòu)研究的未知信息。通過結(jié)構(gòu)分析及生化實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,鑒別出了Xyl E在轉(zhuǎn)運(yùn)過程中識(shí)別底物的關(guān)鍵氨基酸殘基。借助計(jì)算機(jī)軟件同源建模的手段,建立人源GLUT1的三維蛋白結(jié)構(gòu)模型。在該同源結(jié)構(gòu)模型中,成功定位了一些I型GLUT家族成員疾病相關(guān)的突變殘基,初步適用于致病機(jī)理研究。另外通過Xyl E和I型GLUT家族成員的序列比對(duì)分析,結(jié)合生化實(shí)驗(yàn),進(jìn)一步鑒定出Xyl E中第27位的天冬氨酸對(duì)于轉(zhuǎn)運(yùn)過程中質(zhì)子耦聯(lián)的調(diào)控作用。同樣根據(jù)序列比對(duì)分析設(shè)計(jì)氨基酸突變,能改變Xyl E對(duì)底物的選擇特異性,使其一定程度上具備轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖的能力。以上研究開啟了理解糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的新篇章,擴(kuò)充了對(duì)MFS超家族蛋白的普遍認(rèn)識(shí),也為后續(xù)直接研究GLUT家族打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。
[Abstract]:Carbohydrate metabolism plays a key role in metabolism and other life activities, and glucose metabolism is the most important. Sugar into cells must pass through the sugar transporter on the membrane of the cell. For glucose, there are two types of transporters in the human body, which are closely related to a variety of physiological and pathological activities. In this paper, one of the GLUT family proteins was selected as the research object and was examined with its prokaryotic homologous protein Xyl E. Xyl E, derived from Escherichia coli, is a xylose specific to the substrate: proton co transporter, which is similar to 50% of the I type GLUT family members. Glucose can inhibit the transport of Xyl E and can not be transported by Xyl E; the transport substrate of I type GLUT family, unlike Xyl E, requires proton participation. Therefore, the transport mechanism of Xyl E is still different from the members of the I type GLUT family. In order to further understand the mechanism of these sugar transporters, we have obtained the structure of Xyl E combined with substrate xylose, substrate analogues glucose and synthetic glucose bromine derivatives by X ray crystallography. The resolution is 2.8, 2.9 and 2.6, respectively. These three Xyl E structures show a classic 12 transmembrane alpha helical MFS folding mode, but in the intracellular region, there is a four alpha helix domain with a new conformation opening and partially closed to the cell, which improves the unknown information of the family structure. The key amino acid residues identified by Xyl E during the transport process were identified by structural analysis and biochemical test. With the help of computer software homologous modeling, a three-dimensional protein structure model of human GLUT1 was established. In this homologous structural model, a number of disease related mutations related to the I type GLUT family members have been successfully located, which are preliminarily applied to the study of pathogenic mechanism. In addition, through sequence alignment analysis of Xyl E and I GLUT family members, combined with biochemical experiments, we further identified the role of twenty-seventh aspartate in Xyl E in regulating proton coupling during transport. According to the sequence alignment analysis, the design of amino acid mutation can change the selectivity of Xyl E to the substrate, so that it has the ability to transport glucose to a certain extent. The above research opens a new chapter to understand the transport mechanism of sugar transporters, expands the universal understanding of MFS superfamily proteins, and lays a solid foundation for further study of GLUT family.
【學(xué)位授予單位】：清華大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q51

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