本文關(guān)鍵詞：矮牽牛轉(zhuǎn)錄因子PhOBF1和PhERF2影響病毒誘導(dǎo)基因沉默效率的機(jī)理研究　出處：《西北農(nóng)林科技大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：病毒誘導(dǎo)基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)是植物分子生物學(xué)領(lǐng)域中分析基因功能常用的技術(shù)手段。攜帶某一基因片段的病毒載體侵染后,導(dǎo)致植物體內(nèi)同源mRNA轉(zhuǎn)錄水平的降解,因此屬于轉(zhuǎn)錄后的基因沉默(post-transcriptional gene silencing,PTGS)。PDS和CHS分別是利用VIGS方法研究葉片和花器官中相關(guān)基因功能的常用報(bào)告基因,其沉默導(dǎo)致的可見表現(xiàn)型可用于指示VIGS沉默位置或沉默效率。病毒誘導(dǎo)的RNA沉默參與植株抗病毒防御反應(yīng),需要依賴于RNA的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RDRs)、類似于Dicer的內(nèi)切酶RNase III(Dicer-like RNase III enzymes,DCLs)及Argonaute蛋白(Argonaute proteins,AGOs)。然而,這些關(guān)鍵成分的轉(zhuǎn)錄調(diào)控尚不清楚。本研究在前期矮牽牛花器官不同發(fā)育階段的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序工作中,分離得到一個(gè)bZIP型轉(zhuǎn)錄因子和一個(gè)ERF型轉(zhuǎn)錄因子,分別命名為PhOBF1和PhERF2。選用矮牽牛(Petunia×hybrida)紫花品種‘Primetime Blue’和白花品種‘Mitchell Diploid’為材料,研究了TRV侵染、非生物因素及壓力相關(guān)激素處理下的PhOBF1或PhERF2的表達(dá)模式;分析了PhOBF1或PhERF2對(duì)RNA沉默相關(guān)基因的調(diào)控和對(duì)煙草脆裂病毒(Tobacco rattle virus,TRV)誘導(dǎo)的基因沉默效率的影響;檢測(cè)了PhOBF1或PhERF2轉(zhuǎn)基因植株對(duì)不同病毒侵染的抗性差異,主要取得以下結(jié)果:1.在通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序構(gòu)建的矮牽�；ㄆ鞴俨煌l(fā)育時(shí)期的cDNA文庫(kù)中,分離得到PhOBF1和PhERF2的EST片段,NCBI的BLAST搜索發(fā)現(xiàn)兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的完整開放閱讀框(open reading frame,ORF)序列。其中,PhOBF1 mRNA長(zhǎng)度為915bp,ORF區(qū)489bp,編碼162個(gè)氨基酸,5’端非編碼區(qū)含有一個(gè)蔗糖控制的uORF區(qū),長(zhǎng)度為147bp,編碼48個(gè)氨基酸,Genbank登錄號(hào):FN001301;PhERF2 mRNA長(zhǎng)度為1308bp,ORF區(qū)1137bp,編碼378個(gè)氨基酸,Genbank登錄號(hào):HQ259596。在PhOBF1和PhERF2氨基酸序列中分別含有一個(gè)bZIP保守結(jié)構(gòu)域和一個(gè)AP2/ERF保守結(jié)構(gòu)域。系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示,PhOBF1屬于bZIP型轉(zhuǎn)錄因子S亞族,與擬南芥AtbZIP11高度同源;PhERF2屬于ERF型轉(zhuǎn)錄因子VII亞族,與擬南芥AtRAP2.12和AtRAP2.2高度同源。2.TRV接種矮牽牛后,在接種葉片和頂端系統(tǒng)葉片中PhOBF1或PhERF2的轉(zhuǎn)錄水平升高,且升高的趨勢(shì)與葉片中TRV RNA1(或TRV1)和RNA2(或TRV2)的積累水平一致。除了生物因素外,采用非生物因素及激素處理矮牽牛葉片,檢測(cè)了兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)情況。結(jié)果顯示,低溫、干旱、脫落酸、乙烯、赤霉素和水楊酸處理誘導(dǎo)PhOBF1的表達(dá),而低溫、高鹽堿、干旱、脫落酸、乙烯、水楊酸和茉莉酸甲酯處理誘導(dǎo)pherf2的表達(dá)。在非生物脅迫下,低溫處理對(duì)phobf1或pherf2的誘導(dǎo)量最大,其次是干旱;而在所有激素中,水楊酸處理結(jié)果顯示對(duì)phobf1或pherf2的最大誘導(dǎo)。表明兩個(gè)轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄因子可能在矮牽牛植株抗非生物脅迫方面扮演著重要角色。此外,乙烯處理顯著誘導(dǎo)了phobf1或pherf2的表達(dá),由于矮牽牛屬于乙烯敏感型,乙烯是矮牽牛花朵從開放到萎蔫的主要信號(hào),因此推斷phobf1或pherf2可能參與矮牽�；ㄆ鞴偎ダ系恼{(diào)節(jié)。3.以trv為載體,pds或chs為報(bào)告基因,將phobf1或pherf2片段構(gòu)建到trv-phpds/chs、trv-phpds或trv-phchs中,采用注射法將轉(zhuǎn)化各種trv構(gòu)建物的農(nóng)桿菌接種野生型矮牽牛幼苗葉片,接種未轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌用作mock對(duì)照。接種后不同時(shí)期,頂端系統(tǒng)侵染葉片或花瓣上始終未出現(xiàn)pds沉默導(dǎo)致的光漂白表現(xiàn)型或chs沉默引起的白花表現(xiàn)型。病毒積累水平的半定量結(jié)果顯示,trvrna1(或trv1)和攜帶phobf1或pherf2插入片段的rna2(或trv2)成功侵染至頂端系統(tǒng)葉片,表明phobf1或pherf2插入片段的存在并未抑制trv載體的復(fù)制和移動(dòng),從而排除由于病毒增殖受到抑制而引起報(bào)告基因沉默失敗的可能性。實(shí)時(shí)熒光定量pcr分析結(jié)果顯示,trv-phpds/obf1或trv-phpds/erf2侵染的系統(tǒng)葉片中pds轉(zhuǎn)錄水平只相比于mock對(duì)照下降了30-40%,trv-phpds侵染的光漂白葉片中下降了約90%的pds轉(zhuǎn)錄水平。phobf1或pherf2的下調(diào)表達(dá)導(dǎo)致某些rna沉默相關(guān)基因rdrs、dcls和agos下降的轉(zhuǎn)錄水平和幾乎難以檢測(cè)到的sirnas積累水平。表明phobf1或pherf2可能通過調(diào)控rna沉默途徑關(guān)鍵基因的表達(dá),進(jìn)而影響trv誘導(dǎo)的基因沉默效率。4.采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法,生成了phobf1的rnai沉默(#2,#6和#8)和過表達(dá)(#b,#d和#h)轉(zhuǎn)基因植株,或pherf2的rnai沉默(#1和#4)和過表達(dá)(#c,#d和#i)轉(zhuǎn)基因植株。植株表現(xiàn)型觀察發(fā)現(xiàn)phobf1影響植株高度、莖枝粗度、葉片厚度和種子大小。pherf2-rnai沉默導(dǎo)致植株減弱的生長(zhǎng)勢(shì),而過表達(dá)導(dǎo)致增強(qiáng)的生長(zhǎng)勢(shì)。phobf1沉默和過表達(dá)分別顯著抑制和促進(jìn)了rna沉默相關(guān)基因rdr1、rdr2、dcl1、dcl2、dcl4和ago2的表達(dá),而pherf2沉默和過表達(dá)分別顯著降低和提高了rdr2、rdr6、dcl2和ago2的轉(zhuǎn)錄水平。trv-phpds接種phobf1或pherf2的rnai沉默和過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株幼苗,野生型植株用作對(duì)照。接種后葉片表現(xiàn)型觀察發(fā)現(xiàn),兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的rnai沉默極大的降低了pds的沉默效率,表現(xiàn)為頂端系統(tǒng)葉片未發(fā)現(xiàn)明顯的pds沉默導(dǎo)致的光漂白表現(xiàn)型。但是,phobf1或pherf2的過表達(dá)恢復(fù)甚至促進(jìn)了pds沉默引起的光漂白表現(xiàn)型。實(shí)時(shí)熒光定量pcr分析顯示,接種trv-phpds的phobf1或pherf2沉默轉(zhuǎn)基因植株系統(tǒng)葉片中的pds轉(zhuǎn)錄水平下降了約30-40%,而接種trv-phpds的對(duì)照野生型植株系統(tǒng)葉片中的pds轉(zhuǎn)錄水平下降了約90%。phobf1或pherf2過表達(dá)導(dǎo)致trv-phpds侵染的系統(tǒng)葉片中pds轉(zhuǎn)錄水平也下降了90%左右。接種trv-phpds后的野生型植株和phobf1或pherf2轉(zhuǎn)基因植株中的trvrna1(或TRV1)和RNA2(或TRV2)的積累水平存在明顯差異。表明PhOBF1或PhERF2不僅參與TRV誘導(dǎo)的基因沉默效率的調(diào)節(jié),還可能參與植株對(duì)TRV侵染的防御反應(yīng)。此外,PhOBF1沉默和過表達(dá)分別下調(diào)和上調(diào)了莽草酸和苯丙素途徑關(guān)鍵基因DAHPS、SK1、EPSPS、CS、CM1、ADT1、PAL1和PAL2的轉(zhuǎn)錄,以及下降和升高的內(nèi)源水楊酸含量。外源水楊酸處理極大地誘導(dǎo)RDR1、RDR2、DCL1、DCL2、DCL4和AGO2的表達(dá)。表明水楊酸可能是連接PhOBF1和下游RNA沉默途徑的重要中間信號(hào)。5.采用注射法接種TRV空載體或TRV-GFP載體,檢測(cè)了PhOBF1-或PhERF2-RNAi沉默和過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株對(duì)TRV的抗性。采用摩擦法接種煙草花葉病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)和黃瓜花葉病毒(Cucumber mosaic virus,CMV),分別檢測(cè)了PhOBF1轉(zhuǎn)基因植株對(duì)TMV或PhERF2轉(zhuǎn)基因植株對(duì)CMV的抗性。接種TRV-GFP后,PhOBF1沉默轉(zhuǎn)基因植株接種葉片顯示出比野生型植株接種葉片更大的綠色熒光相對(duì)區(qū)域,而PhOBF1過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株接種葉片顯示出較小的綠色熒光相對(duì)面積。接種TRV空載體的PhOBF1或PhERF2沉默轉(zhuǎn)基因植株系統(tǒng)葉片出現(xiàn)較嚴(yán)重的花葉、斑駁或退綠癥狀,實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析顯示兩者的沉默植株中具有比野生型植株更多的TRV RNA1(或TRV1)和RNA2(或TRV2)積累水平。PhOBF1過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株系統(tǒng)葉片TRV侵染癥狀較輕,未發(fā)現(xiàn)明顯的花葉、斑駁或退綠癥狀,實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析顯示,與野生型植株相比,PhOBF1過表達(dá)導(dǎo)致下降的TRV RNA1(或TRV1)和RNA2(或TRV2)積累水平。此外,PhOBF1沉默和過表達(dá)顯著提高和降低了TMV外殼蛋白基因TMV-CP的表達(dá)水平,而PhERF2沉默和過表達(dá)顯著增強(qiáng)和抑制了CMV外殼蛋白基因CMV-CP的表達(dá)水平。表明PhOBF1或PhERF2可能參與對(duì)多種病毒侵染的廣譜的抗性反應(yīng)。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q943.2;S432.41
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本文編號(hào)：1330251