本文關(guān)鍵詞：氧化葡萄糖酸桿菌中NADH脫氫酶Ⅱ的酶學(xué)性質(zhì)及其功能研究　出處：《華東理工大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：氧化葡萄糖酸桿菌(G. oxydans)因具有大量的膜結(jié)合脫氫酶、可以快速不完全氧化多種糖、醇化合物,成為一種重要的工業(yè)應(yīng)用菌株。這些膜結(jié)合脫氫酶氧化產(chǎn)生的電子直接傳遞進(jìn)入呼吸鏈,然而該菌呼吸鏈中一些組分的功能還有待研究,例如其中的NADH脫氫酶Ⅱ(NDH-2)。為了闡明NDH-2在G. oxydans DSM 2003中的生理功能,本論文通過(guò)基因的異源表達(dá)研究其酶學(xué)性質(zhì),通過(guò)基因的同源表達(dá)結(jié)合實(shí)時(shí)定量PCR、二維電泳、生物催化等實(shí)驗(yàn)研究該酶對(duì)菌體生長(zhǎng)、能量代謝的影響。同時(shí)為了研究的需要以及基于G. oxydans分子操作工具的有限性,篩選適用于該微生物的新型強(qiáng)啟動(dòng)子。具體內(nèi)容如下：第一部分,NDH-2的酶學(xué)性質(zhì)及功能研究(1)NDH-2的酶學(xué)性質(zhì)分析。G. oxydans DSM 2003中的NDH-2是一個(gè)編碼409個(gè)氨基酸的脂溶性的膜結(jié)合蛋白,表觀分子量約為45 kDa,為單亞基酶；擁有2個(gè)典型的GXGXXG保守區(qū),屬于A組NDH-2；最適反應(yīng)溫度為30℃,最適反應(yīng)pH 7.5～8,非共價(jià)結(jié)合黃素輔因子FAD,無(wú)Fe-S簇,以NADH為唯一電子供體,不能還原NADPH,最適電子受體為輔酶Q2。(2)NDH-2過(guò)表達(dá)對(duì)碳源代謝的影響。使用其自身啟動(dòng)子實(shí)現(xiàn)NDH-2在G.oxydans中的同源過(guò)表達(dá),這使得L-山梨糖還原酶(SR)、6-磷酸葡萄糖脫氫酶(6pgDH)和6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶(6pgDH)酶活分別提高了47.4%、60%和36.4%,從而提高了胞內(nèi)戊糖磷酸途徑的活力,促進(jìn)了L-山梨糖的代謝(較對(duì)照提高10倍),碳源利用率從28.7%提高至57.8%,最終OD600從11.54增加到17.91,提高42.8%。以上結(jié)果說(shuō)明NDH-2可以通過(guò)影響胞內(nèi)NADH/NAD+的平衡,引起一系列胞內(nèi)代謝及代謝關(guān)鍵酶表達(dá)量的改變,從而影響碳源的吸收與利用,以適應(yīng)菌體對(duì)遲效碳源(例如L-山梨糖)的利用以及因發(fā)酵液中次級(jí)產(chǎn)物增加而提升的生長(zhǎng)壓力。(3)NDH-2過(guò)表達(dá)對(duì)能量代謝的影響。NDH-2的過(guò)表達(dá)引起了呼吸鏈中各組分(bd、bo3、bc1、細(xì)胞色素c和轉(zhuǎn)氫酶pntAB)轉(zhuǎn)錄水平不同程度的降低,但是卻促進(jìn)了一些電子傳遞相關(guān)蛋白(電子傳遞黃素蛋白、乙醇脫氫酶c亞基、ATP合成酶α1亞基、氧化還原酶鐵硫結(jié)合亞基)表達(dá)量的提高,結(jié)合NDH-2過(guò)表達(dá)菌中增加的OUR以及H+/O(47.6%),說(shuō)明NDH-2可以影響G. oxydans的呼吸強(qiáng)度、電子傳遞效率、氧化磷酸化效率及能量的產(chǎn)生,從而影響菌體的生長(zhǎng)。此外,NDH-2的過(guò)表達(dá)沒(méi)有影響膜上一些主要脫氫酶(葡萄糖脫氫酶、山梨醇脫氫酶、乙醇脫氫酶)的表達(dá),說(shuō)明NDH-2與膜結(jié)合脫氫酶介導(dǎo)的非氧化磷酸化和胞內(nèi)代謝之間并不存在十分明顯的電子競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系。第二部分,G. oxydans適用的新型強(qiáng)啟動(dòng)子的篩選及應(yīng)用使用探針質(zhì)粒篩選得到一啟動(dòng)子片段(104bp),命名為gHp0169。gHp0169可有效啟動(dòng)外源基因和內(nèi)源基因在G.oxydans的高效表達(dá),且啟動(dòng)活性略高于該菌中常用啟動(dòng)子G.oxydans_tufB。將gHp01矽用于構(gòu)建高效表達(dá)2-葡萄糖酸脫氫酶(GA2DH)的G.oxydnns工程菌,產(chǎn)物2-KGA的時(shí)空產(chǎn)率達(dá)到29.86mM/h,較對(duì)照菌提高2倍,得率從84%提高至98.3%。
【學(xué)位授予單位】：華東理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q936

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8 朱u嚾，

本文編號(hào)：1327195