本文關(guān)鍵詞：TLR3調(diào)控新城疫病毒復(fù)制及細(xì)胞自噬的分子機(jī)制研究　出處：《揚(yáng)州大學(xué)》2016年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

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【摘要】：新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)可以引起禽類(lèi)的呼吸道疾病和死亡,給養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。NDV也能在人類(lèi)腫瘤細(xì)胞中復(fù)制并破壞腫瘤細(xì)胞,因此作為一種溶瘤病毒被廣泛關(guān)注。近年來(lái),病毒感染誘導(dǎo)的天然免疫機(jī)制逐漸成為研究熱點(diǎn)。Toll樣受體(toll-like receptors, TLRs)是新發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)細(xì)胞表面受體,其中的TLR3能夠識(shí)別病毒相關(guān)的dsRNA或dsRNA模擬物poly (I:C),在抗病毒天然免疫中發(fā)揮重要作用。目前,關(guān)于NDV誘導(dǎo)的TLR3信號(hào)通路及其對(duì)病毒復(fù)制的影響還沒(méi)有相關(guān)報(bào)道,激活的TLR3信號(hào)通路與細(xì)胞自噬之間是否具有聯(lián)系也不清楚。為了探究這些問(wèn)題,我們開(kāi)展了以下的研究：1.NDV感染與TLR3信號(hào)通路的激活用NDV Herts/33強(qiáng)毒株感染HeLa細(xì)胞系,以Western-blot和免疫熒光方法鑒定被感染細(xì)胞的TLR3變化。發(fā)現(xiàn)Herts/33強(qiáng)毒株感染能夠顯著提高TLR3的水平,在感染后12-24h最為明顯。使用dsRNA特異性抗體進(jìn)行染色,發(fā)現(xiàn)NDV復(fù)制過(guò)程中能夠產(chǎn)生dsRNA,并激活TLR3信號(hào)通路；而紫外滅活的NDV不能激活該通路。采用NDV La Sota弱毒株進(jìn)行了相同的實(shí)驗(yàn),所得到的結(jié)果與Herts/33強(qiáng)毒株相同。由此可見(jiàn),NDV在感染細(xì)胞內(nèi)復(fù)制過(guò)程中產(chǎn)生的dsRNA能夠被TLR3識(shí)別并將其活化。2.TLR3信號(hào)通路與NDV復(fù)制的關(guān)系構(gòu)建人TLR3 (hTLR3)的真核表達(dá)質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞系后檢測(cè)過(guò)表達(dá)TLR3對(duì)NDV感染的影響。hTLR3過(guò)表達(dá)能夠顯著抑制病毒蛋白的轉(zhuǎn)錄和翻譯,減少細(xì)胞上清中的病毒滴度。將TLR3干擾RNA (siRNA)轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞系后,TLR3的表達(dá)受到抑制,病毒蛋白的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上調(diào),病毒滴度增加。以real-time PCR檢測(cè)過(guò)表達(dá)TLR3后對(duì)干擾素和炎性因子產(chǎn)生的影響,IFN-β、IL-6、 IL-8和IFIT1 mRNA水平與對(duì)照組發(fā)生顯著變化。使用熒光素酶報(bào)告基因的方法檢測(cè)了轉(zhuǎn)染TLR3的細(xì)胞在感染NDV以后IFN-β、NF-κB啟動(dòng)子活性,兩個(gè)啟動(dòng)子的活性顯著增強(qiáng)。上述結(jié)果表明,TLR3在NDV感染中通過(guò)誘導(dǎo)干擾素的釋放和炎癥因子的產(chǎn)生發(fā)揮其抗病毒作用。3.抗NDV感染天然免疫中TLR3和RIG-I信號(hào)通路的關(guān)系評(píng)價(jià)了TLR3和視黃酸誘導(dǎo)基因蛋白-I(retinoic acid-inducible gene 1, RIG-I)信號(hào)通路在抗NDV感染中作用。將TLR3 siRNA、RIG-I siRNA、TLR3 siRNA+RIG-I siRNA分別轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞,然后感染NDV,以real-time PCR的方法檢測(cè)IFN-β、IL-6、IL-8.IFIT1 mRNA水平的變化。發(fā)現(xiàn)單獨(dú)干擾TLR3的細(xì)胞中炎癥因子IL-6、IL-8 mRNA表達(dá)的水平低于單獨(dú)干擾RIG-I的細(xì)胞,而單獨(dú)干擾RIG-I的細(xì)胞中IFN-p mRNA表達(dá)水平低于單獨(dú)干擾TLR3的細(xì)胞。此外我們還通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因的方法檢測(cè)了IFN-β、NF-κB啟動(dòng)子活性的變化,同樣發(fā)現(xiàn)單獨(dú)干擾TLR3時(shí)NF-κB啟動(dòng)子的活性低于單獨(dú)干擾RIG-I時(shí),單獨(dú)干擾RIG-I時(shí)IFN-β啟動(dòng)子的活性低于單獨(dú)干擾TLR3。綜上所述,兩種天然免疫的模式識(shí)別受體TLR3和RIG-I對(duì)下游干擾素和炎性因子的調(diào)節(jié)方式是不同的,兩者共同參與了NDV介導(dǎo)天然免疫反應(yīng)。4.TLR3信號(hào)-通路激活與細(xì)胞自噬的關(guān)系用TLR3配體poly (I:C)處理A549細(xì)胞系,轉(zhuǎn)染GFP-LC3質(zhì)粒12-24 h后,GFP-LC3在細(xì)胞中呈現(xiàn)顯著的點(diǎn)狀分布;Western-blot顯示細(xì)胞內(nèi)的LC3-I向LC3-Ⅱ的轉(zhuǎn)化。同時(shí),用poly(I:C)處理HeLa田胞系,也得到了相同的結(jié)果。說(shuō)明TLR3激活后可以引起自噬。為了探究TLR3激活后引起的白噬是否為完整的自噬,我們用poly(I:C)刺激后對(duì)p62的降解進(jìn)行了檢測(cè),使用溶酶體抑制劑處理后western-blot檢測(cè)LC3-II的turnover,并且通過(guò)熒光觀察了GFP-LC3與LAMP1的共定位。綜上所述,poly (I:C)刺激后能夠引起細(xì)胞自噬,并且產(chǎn)生完整的自噬流。5.TLR3信號(hào)通路激活后誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的機(jī)制通過(guò)免疫熒光的方法,觀察了TLR3及下游蛋白與Beclin-1的共定位。通過(guò)免疫共沉淀的方法,對(duì)TLR3及下游接頭蛋白與自噬相關(guān)蛋白進(jìn)行互作研究。結(jié)果顯示,TLR3信號(hào)通路激活后,下游接頭蛋白TRIF與Beclin-1能夠發(fā)生部分共定位,并且發(fā)生相互作用,互作的區(qū)域在TRIF的TIR結(jié)合域和Beclin的BH3功能域。自噬未激活時(shí),Beclin-1與B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2, Bcl-2)結(jié)合。綜上所述,TLR3信號(hào)通路激活后,下游接頭蛋白TRIF與Beclin-1相互作用,競(jìng)爭(zhēng)性地抑制Bcl-2與Beclin-1結(jié)合,正向調(diào)控細(xì)胞白噬的過(guò)程。6.NDV病毒蛋白NP、P通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞自噬分別構(gòu)建了NDV各結(jié)構(gòu)蛋白的真核表達(dá)質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞系,以Western-blot和熒光試驗(yàn)鑒定細(xì)胞自噬的產(chǎn)生以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)的改變。結(jié)果顯示,NDV NP和P轉(zhuǎn)染細(xì)胞后能夠引起細(xì)胞自噬以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。此外NP和P還能夠激活非折疊蛋白通路(unfolded protein response, UPR)中的PERK和ATF6通路,而XBP1通路不被激活。將PERK和ATF6干擾后能夠抑制NDV誘導(dǎo)的自噬,降低NDV的復(fù)制水平。結(jié)論：本研究證明了TLR3信號(hào)通路在NDV感染細(xì)胞后可以被激活,TLR3通過(guò)促進(jìn)下游細(xì)胞因子和干擾素的釋放發(fā)揮抗病毒作用；證實(shí)Beclin-1能與TLR3信號(hào)通路中的接頭蛋白TRIF互作,促進(jìn)自噬的發(fā)生；發(fā)現(xiàn)NDV的NP和P蛋白能夠通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)的非折疊蛋白通路調(diào)控細(xì)胞自噬。
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：S852.65

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