本文關(guān)鍵詞：縮宮素對(duì)肥大細(xì)胞脫顆粒和DRG神經(jīng)元興奮性的影響及其機(jī)制研究　出處：《山東大學(xué)》2016年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

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【摘要】：疼痛影響人們生活的各個(gè)方面,雖然現(xiàn)代醫(yī)學(xué)取得巨大進(jìn)步,但是許多慢性痛仍然是醫(yī)學(xué)所面臨的重大挑戰(zhàn)。在消化系統(tǒng)中,內(nèi)臟慢性痛主要見(jiàn)于功能性腸病(例如,慢性特發(fā)性消化不良,功能性腹痛,腸易激綜合癥等),其中最常見(jiàn)于腸易激綜合癥(irritable bowel syndrome,IBS)。目前對(duì)內(nèi)臟痛的研究發(fā)現(xiàn),中樞和外周機(jī)制均起重要作用。中樞神經(jīng)系統(tǒng)中,腦腸軸機(jī)制越來(lái)越凸顯；在外周,免疫機(jī)制以及神經(jīng)-免疫關(guān)聯(lián)在內(nèi)臟痛發(fā)生中發(fā)揮重要的作用�？s宮素(oxytocin,OT)是由九個(gè)氨基酸組成的神經(jīng)肽,主要由下丘腦的室旁核和視上核合成。OT在臨床上主要用于引產(chǎn)、催產(chǎn)、產(chǎn)后出血以及促排乳。近些年研究表明,OT及縮宮素受體(oxytocin receptor,OTR)在腸道中表達(dá),而且在腸道運(yùn)動(dòng)和感覺(jué),腸道炎癥的調(diào)節(jié),腸粘膜結(jié)構(gòu)功能的維持等方面發(fā)揮重要的作用。越來(lái)越多的研究證實(shí),在外周器官應(yīng)用OT(靜脈注射、腹腔注射、皮下注射以及結(jié)腸灌注),能顯著抑制內(nèi)臟痛的發(fā)生。深入研究OT對(duì)內(nèi)臟痛的作用及其機(jī)制,可為預(yù)防和治療內(nèi)臟痛提供新的方法和依據(jù)。本研究主要從免疫和神經(jīng)兩方面探討OT的外周鎮(zhèn)痛機(jī)制。第一部分：縮宮素對(duì)結(jié)腸高敏感大鼠肥大細(xì)胞脫顆粒的影響及其機(jī)制研究目的已有文獻(xiàn)報(bào)道,OT和OTR在腸道中表達(dá),OT能顯著抑制內(nèi)臟痛及內(nèi)臟高敏感的發(fā)生。然而,機(jī)制尚不明確。研究發(fā)現(xiàn),IBS患者腹痛的嚴(yán)重程度及頻率與結(jié)腸神經(jīng)周?chē)姆蚀蠹?xì)胞數(shù)目有關(guān),而且肥大細(xì)胞激活通過(guò)脫顆粒并釋放炎性介質(zhì),增強(qiáng)腸神經(jīng)以及背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglion,DRG)神經(jīng)元的興奮性,從而導(dǎo)致內(nèi)臟高敏感。本研究的目的是探討OT對(duì)肥大細(xì)胞脫顆粒的作用及其機(jī)制,以期揭示OT抑制內(nèi)臟痛的外周免疫機(jī)制。方法通過(guò)免疫熒光實(shí)驗(yàn)和蛋白免疫印跡(Western Blot)實(shí)驗(yàn),檢測(cè)OTR在肥大細(xì)胞的表達(dá)。給予大鼠結(jié)腸灌注三硝基苯磺酸(2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid, TNBS),來(lái)誘導(dǎo)結(jié)腸高敏感動(dòng)物模型,采取結(jié)腸灌注OT的方法研究OT對(duì)結(jié)腸高敏感大鼠的作用。使用甲苯胺藍(lán)標(biāo)記大鼠結(jié)腸組織切片中的肥大細(xì)胞,觀察肥大細(xì)胞的數(shù)目和脫顆粒情況。肥大細(xì)胞激活后釋放的組胺含量通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒進(jìn)行測(cè)定。運(yùn)用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄肥大細(xì)胞的膜離子流。通過(guò)鈣成像設(shè)備檢測(cè)肥大細(xì)胞內(nèi)鈣離子Ca2+的變化。結(jié)果1.0TR在肥大細(xì)胞上的表達(dá)免疫熒光實(shí)驗(yàn)證實(shí),OTR在人和大鼠結(jié)腸組織的肥大細(xì)胞上表達(dá)。潰瘍性結(jié)腸炎患者以及TNBS誘導(dǎo)的內(nèi)臟高敏感模型大鼠的結(jié)腸組織中OTR表達(dá)陽(yáng)性的肥大細(xì)胞比例均顯著升高。OTR也表達(dá)于人肥大細(xì)胞株-1(human mast cell line-1,HMC-1)和小鼠肥大細(xì)胞瘤細(xì)胞株(mouse mastocytoma cell line,P815)。2.0T對(duì)肥大細(xì)胞脫顆粒的影響OT能顯著抑制TNBS誘導(dǎo)的結(jié)腸高敏感模型大鼠結(jié)腸肥大細(xì)胞脫顆粒。經(jīng)OT灌腸的TNBS模型大鼠結(jié)腸切片中脫顆粒肥大細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)(53.5%,38/71),顯著低于TNBS模型大鼠(81.9%,59/72)。3.0T對(duì)肥大細(xì)胞脫顆粒時(shí)釋放組胺的影響采用化合物48/80(compound 48/80,C48/80)誘導(dǎo)P815細(xì)胞脫顆粒,釋放組胺,10-6M OT預(yù)處理細(xì)胞后,C48/80誘導(dǎo)P815細(xì)胞釋放組胺的含量明顯降低。4.0T對(duì)肥大細(xì)胞內(nèi)向電流的影響用全細(xì)胞膜片鉗記錄的方法來(lái)測(cè)定OT對(duì)C48/80誘導(dǎo)HMC-1細(xì)胞和P815細(xì)胞產(chǎn)生內(nèi)向電流的作用。在電壓鉗模式下,細(xì)胞被鉗制在-60 mV,用C48/80持續(xù)作用HMC-1細(xì)胞或者P815細(xì)胞,兩種細(xì)胞均產(chǎn)生明顯的內(nèi)向電流。OT預(yù)處理兩種細(xì)胞后,C48/80誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生的內(nèi)向電流均明顯減小5.0TR拮抗劑和一氧化氮合酶(nitrio oxide synthase,NOS)抑制劑對(duì)0T作用的影響用OTR的阻斷劑阿托西班(atosiban)或者非選擇性NOS抑制劑NG-Methyl-L-arginine acetate salt(L-NMMA)預(yù)處理后,OT對(duì)C48/80誘導(dǎo)P815細(xì)胞組胺釋放的抑制作用被顯著逆轉(zhuǎn),OT對(duì)C48/80誘導(dǎo)HMC-1細(xì)胞和P815細(xì)胞內(nèi)向電流的抑制作用同樣被顯著逆轉(zhuǎn)。6.0T對(duì)肥大細(xì)胞內(nèi)鈣離子的影響用Fura-2作為鈣離子的熒光染料,用鈣成像設(shè)備分別記錄340 nm和380 nm激發(fā)出的發(fā)射光強(qiáng)度值F340和F380,以F340/F380的比值來(lái)體現(xiàn)胞內(nèi)鈣離子的水平。不同濃度的OT作用HMC-1細(xì)胞或者P815細(xì)胞后,細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度呈劑量依賴(lài)性增高。結(jié)論1.肥大細(xì)胞上表達(dá)OTR,潰瘍性結(jié)腸炎患者以及TNBS誘導(dǎo)的結(jié)腸高敏感模型大鼠的結(jié)腸組織中表達(dá)OTR的肥大細(xì)胞比例均顯著增高。2.外源性O(shè)T可抑制結(jié)腸高敏感大鼠的結(jié)腸肥大細(xì)胞脫顆粒,進(jìn)而發(fā)揮對(duì)結(jié)腸高敏感性的抑制作用。3.外源性O(shè)T可能通過(guò)Ca2+-NOS信號(hào)通路抑制肥大細(xì)胞脫顆粒。第二部分：縮宮素對(duì)正常大鼠背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元興奮性的影響及其機(jī)制研究目的OT在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的鎮(zhèn)痛作用。然而,OT在外周的鎮(zhèn)痛作用雖然也有報(bào)道,但機(jī)制不清。本研究的目的是探討OT對(duì)DRG神經(jīng)元電生理特性的影響,以期揭示OT鎮(zhèn)痛的外周神經(jīng)系統(tǒng)機(jī)制。方法急性分離DRG神經(jīng)元并培養(yǎng)。通過(guò)鈣離子成像技術(shù),檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣離子的變化。運(yùn)用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù),記錄DRG神經(jīng)元的電生理特性。免疫熒光實(shí)驗(yàn)用于檢測(cè)OTR和神經(jīng)型一氧化氮合成酶(neuronal nitric oxide synthase,nNOS)在DRG神經(jīng)元中的表達(dá)及分布。采用免疫熒光實(shí)驗(yàn)和硝酸還原酶法檢測(cè)DRG神經(jīng)元內(nèi)一氧化氮(nitric oxide,NO)的含量。結(jié)果1.OT對(duì)DRG神經(jīng)元興奮性的影響OT能夠明顯降低小型DRG神經(jīng)元(直徑20-27μM)的興奮性,這可能跟OT使外向電流增大,引起細(xì)胞膜超極化有關(guān)。OT作用小型DRG神經(jīng)元后,能夠引發(fā)動(dòng)作電位的閾刺激強(qiáng)度顯著增大,而且同等強(qiáng)度的刺激下(正常情況下2倍或者3倍閾刺激強(qiáng)度)引發(fā)動(dòng)作電位的數(shù)量明顯減少。此外,OT可使電壓誘導(dǎo)的外向電流顯著增大,并可引起細(xì)胞膜超極化。2.nNOS抑制劑對(duì)OT引起DRG神經(jīng)元超極化的影響用選擇性的nNOS抑制劑N-Propy1-L-arginine(NPLA)預(yù)處理細(xì)胞,可以明顯降低OT引起的DRG神經(jīng)元超極化。3.OT對(duì)DRG神經(jīng)元胞內(nèi)NO含量的影響免疫熒光和硝酸還原酶法監(jiān)測(cè)NO的方法均顯示,OT能夠顯著提高大鼠急性分離的DRG神經(jīng)元和DRG組織內(nèi)NO含量。用選擇性的nNOS抑制劑NPLA預(yù)處理細(xì)胞,可以明顯逆轉(zhuǎn)OT引起的大鼠DRG組織內(nèi)和急性分離的DRG神經(jīng)元胞內(nèi)NO含量的升高。4.OTR和nNOS在痛覺(jué)相關(guān)性DRG神經(jīng)元上共表達(dá)免疫熒光實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),大于85% IB4標(biāo)記的痛覺(jué)相關(guān)性神經(jīng)元上,同時(shí)表達(dá)OTR和iNOS。5.三磷酸腺苷敏感性鉀通道(adenosine triphosphate sensitive potassium channel,KATP)的阻斷劑對(duì)OT電生理作用的影響KATP的阻斷劑格列本脲(glibenclamide)明顯減弱OT引起的大鼠DRG神經(jīng)元超極化和外向電流增大的效應(yīng)。6.OT對(duì)DRG神經(jīng)元胞內(nèi)鈣離子的影響OT可以引起小型DRG神經(jīng)元胞內(nèi)鈣離子劑量依賴(lài)性的增加。結(jié)論1.OTR和nNOS在IB4標(biāo)記的痛覺(jué)相關(guān)性DRG神經(jīng)元上共表達(dá)。2.OT能夠引起小型DRG神經(jīng)元細(xì)胞膜超極化并顯著降低其興奮性,進(jìn)而發(fā)揮外周鎮(zhèn)痛作用。3.OT可能通過(guò)激活DRG神經(jīng)元內(nèi)Ca2+/nNOS/NO/KATP信號(hào)通路,引起細(xì)胞膜超極化。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R33
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本文編號(hào)：1311080