本文關(guān)鍵詞：趨磁細(xì)菌MSR-1磁小體膜蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及MamA的功能解析　出處：《中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)》2016年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

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【摘要】：趨磁細(xì)菌(magnetotactic bacteria, MTB)是一類(lèi)能夠依靠胞內(nèi)鏈狀排列的磁小體(magnetosome)而感知地磁場(chǎng),進(jìn)行定向運(yùn)動(dòng),以尋找適宜生境的原核生物的統(tǒng)稱(chēng)。趨磁細(xì)菌的磁小體是由生物膜包被的Fe304或Fe3S4晶體,磁小體的合成過(guò)程屬于生物礦化過(guò)程,這一過(guò)程受到細(xì)胞的嚴(yán)格控制。磁小體生物合成的分子機(jī)制是趨磁細(xì)菌研究的最大熱點(diǎn),磁小體膜上已確定的特有蛋白有20～40種,這些蛋白分別被命名為磁小體膜(magnetosome membrane, Mam)蛋白。這些Mam蛋白在磁小體的合成中發(fā)揮重要的作用,但它們?cè)诖判◇w合成過(guò)程中是否相互聯(lián)系呢?執(zhí)行這一過(guò)程時(shí)哪些蛋白處于關(guān)鍵位置呢?為解答這些問(wèn)題,本研究以趨磁螺菌Magnetospirillum gryphiswaldense MSR-1為出發(fā)菌株,構(gòu)建選定的17個(gè)Mam蛋白之間的相互作用網(wǎng)絡(luò),并從網(wǎng)絡(luò)中尋找到在磁小體合成過(guò)程中發(fā)揮重要功能的MamA、MamS和MamT蛋白,進(jìn)一步確定它們之間的蛋白相互作用,并研究這三個(gè)基因是如何參與磁小體的合成過(guò)程的。本論文分四部分展開(kāi)。第一部分,為篩選Mam蛋白之間的蛋白相互作用,構(gòu)建了17個(gè)Mam蛋白用于細(xì)菌雙雜交系統(tǒng)蛋白相互作用篩選的載體,進(jìn)行蛋白相互作用初篩,共篩選到62對(duì)可能有相互作用的蛋白,半乳糖苷酶活測(cè)定結(jié)果顯示,MamA與MamS和MamT表現(xiàn)出的酶活比細(xì)菌雙雜交系統(tǒng)正對(duì)照高一倍以上。通過(guò)Cytoscope分析酶活測(cè)定后的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò),聚簇分析表明MamA、MamS、MamT、MamO、MamK這五個(gè)蛋白聚成一組,說(shuō)明這幾個(gè)蛋白之間緊密聯(lián)系,且在磁小體合成這一生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。第二部分,為尋找MamA與MamS和MamT發(fā)生蛋白相互作用的位置對(duì)MamA蛋白進(jìn)行N端截短突變并對(duì)另外兩個(gè)氨基酸進(jìn)行了點(diǎn)突變。通過(guò)細(xì)菌雙雜交系統(tǒng)β-半乳糖苷酶活測(cè)定和大腸桿菌體內(nèi)pull-down兩種方法,確定了完整的MamA與MamS和MamT之間確實(shí)存在相互作用,MamA與MamS發(fā)生相互作用的關(guān)鍵位點(diǎn)為MamA的第159位天冬氨酸；而MamT與MamA的蛋白相互作用與MamA蛋白N端前26個(gè)氨基酸有關(guān)。還通過(guò)細(xì)菌雙雜交系統(tǒng)β-半乳糖苷酶活測(cè)定和蛋白負(fù)染兩種方法確定MamA第50位精氨酸是MamA蛋白自身互作的關(guān)鍵位點(diǎn)。第三部分,為在趨磁細(xì)菌MSR-1中進(jìn)一步確定MamA與MamS和MamT之間的蛋白相互作用,對(duì)mamS和mamT進(jìn)行基因缺失突變并在突變株中對(duì)MamA與綠色熒光蛋白進(jìn)行融合表達(dá)。初步分析突變株表型,透射電鏡(TEM)觀察結(jié)果表明,mamS缺失突變株中磁小體數(shù)目變少,成熟度降低；mamT缺失突變株中磁小體晶型結(jié)構(gòu)遭破壞,但仍沿細(xì)胞長(zhǎng)軸方向呈鏈狀排列。將MamA與綠色熒光蛋白的融合后,分別在野生型MSR-1和兩基因缺失突變株中表達(dá),發(fā)現(xiàn)MamA-GFP在野生型中集中表達(dá)于細(xì)胞中央,方向與細(xì)胞長(zhǎng)軸一致,而在mamS缺失突變株中融合蛋白的熒光彌散于整個(gè)細(xì)胞中,說(shuō)明mamS缺失影響了MamA在趨磁細(xì)菌中的定位。第四部分,磁小體形成另一個(gè)重要因素為鐵,為確定趨磁細(xì)菌鐵吸收與Mam蛋白之間的聯(lián)系,構(gòu)建與鐵的運(yùn)輸、貯存相關(guān)的Bfr1, Bfr2, TolQ, FeoA1, FeoB1共5個(gè)蛋白用于細(xì)菌雙雜交系統(tǒng)蛋白相互作用篩選的載體,篩選這些蛋白與Mam蛋白之間的蛋白相互作用,初篩結(jié)果表明,與鐵相關(guān)的三個(gè)蛋白與MamA、MamS和MamT這幾個(gè)蛋白也有較密切的聯(lián)系,為進(jìn)一步揭示MamA功能提供了一些線索。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：Q93

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本文編號(hào)：1308265