本文關(guān)鍵詞：雨生紅球藻異養(yǎng)細(xì)胞光誘導(dǎo)積累蝦青素工藝的優(yōu)化與放大

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【摘要】：天然蝦青素是一種超強(qiáng)的抗氧化劑,具有巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和廣闊的市場前景,而雨生紅球藻(Haematococcus pluvialis)細(xì)胞被稱為天然蝦青素的“濃縮品”,因此培養(yǎng)雨生紅球藻積累天然蝦青素是當(dāng)今微藻生物技術(shù)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。傳統(tǒng)培養(yǎng)工藝通常分為兩階段：(1)綠色細(xì)胞的光自養(yǎng)培養(yǎng)；(2)綠色細(xì)胞在高光照、缺氮等脅迫條件下積累蝦青素的光誘導(dǎo)。綠色細(xì)胞的光自養(yǎng)通常在逐級(jí)(一般為3級(jí))放大的光生物反應(yīng)器中進(jìn)行,培養(yǎng)過程易污染且營養(yǎng)與光強(qiáng)協(xié)同控制難度大；第二階段脅迫條件下蝦青素合成的機(jī)理尚未明晰,蝦青素積累效率較低,光誘導(dǎo)條件優(yōu)化與反應(yīng)器放大等研究也亟待進(jìn)一步開展。為解決上述問題并對(duì)相關(guān)機(jī)理進(jìn)行深入探討,本文首先用異養(yǎng)代替?zhèn)鹘y(tǒng)的第一階段光自養(yǎng)從而獲得大量細(xì)胞,并觀測異養(yǎng)過程中藻細(xì)胞狀態(tài)的顯著變化。然后摸索不同狀態(tài)的異養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行光誘導(dǎo)產(chǎn)蝦青素的可行性,同時(shí)開展異養(yǎng)轉(zhuǎn)光誘導(dǎo)的機(jī)理研究,提出光適應(yīng)的策略；最后,對(duì)雨生紅球藻異養(yǎng)細(xì)胞光誘導(dǎo)產(chǎn)蝦青素的工藝進(jìn)行放大研究,以期充分發(fā)揮異養(yǎng)效率高的技術(shù)優(yōu)勢并突破雨生紅球藻傳統(tǒng)的光自養(yǎng)產(chǎn)蝦青素的技術(shù)瓶頸。主要內(nèi)容和結(jié)論如下：(1)雨生紅球藻異養(yǎng)過程及放大研究：本文首先在搖瓶上比較了雨生紅球藻異養(yǎng)、自養(yǎng)及混養(yǎng)在細(xì)胞生長方面之差異,混養(yǎng)細(xì)胞增長速率最快,最后所達(dá)到的細(xì)胞數(shù)目也較高,達(dá)到55.5±2.97×104 mL-1,而異養(yǎng)及自養(yǎng)所能達(dá)到的細(xì)胞數(shù)目則分別為36.4±1.9×104 mL-1和9±0.55×104mL-1。隨后的補(bǔ)料分批培養(yǎng)過程表明,利用碳源抑制效應(yīng)可以獲得不同狀態(tài)的細(xì)胞,主要表現(xiàn)為單細(xì)胞重量差別較大(介于0.2～3.5 ng cell-1)；異養(yǎng)過程中,胞內(nèi)的生化組成發(fā)生顯著變化,主要為蛋白含量持續(xù)下降,從初始的約45.67±2.65%降為異養(yǎng)結(jié)束時(shí)的14.16±0.51%,而碳水化合物及油脂的含量則從初始的12.45±0.72%及17.35±1.00%分別提高到45.444±1.64%和30.50±±1.10%；細(xì)胞形態(tài)也發(fā)生著顯著變化,由綠色游動(dòng)細(xì)胞逐步轉(zhuǎn)變?yōu)椴粍?dòng)膠殼細(xì)胞及厚壁孢子態(tài)細(xì)胞。(2)光誘導(dǎo)條件的研究：異養(yǎng)結(jié)束時(shí)胞內(nèi)蝦青素含量很低,僅為0.1-0.5%,因此需要進(jìn)行光誘導(dǎo)以促使蝦青素的累積。搖瓶誘導(dǎo)的結(jié)果表明,初始的最佳碳、氮源為醋酸鈉及硝酸鹽,含量分別為20 mM及2 mM；誘導(dǎo)的pH控制在7-8,適合的pH緩沖體系為40 mM HEPES(4-羥乙基哌嗪乙磺酸)；適合的誘導(dǎo)光強(qiáng)為400 μmol photons m-2s-1；紅光促進(jìn)細(xì)胞的生長,而藍(lán)光則有利于胞內(nèi)蝦青素的積累,白光是最簡單和有效的光源；同等強(qiáng)度的人工光與自然光的誘導(dǎo)結(jié)果接近；連續(xù)光照條件下的細(xì)胞干重及胞內(nèi)蝦青素含量分別為1.9±0.05 g L-1和3.81±0.05%,12 h：12 h光暗循環(huán)條件下相應(yīng)的值為1.54±0.03 g L-1和2.48±0.08%,分別比前者低了18.9%及34.9%；初始細(xì)胞密度與光照強(qiáng)度協(xié)同影響光誘導(dǎo)的結(jié)果,單細(xì)胞受光強(qiáng)度決定了最終的蝦青素產(chǎn)量；在0.1～0.6 vvm的通氣量范圍內(nèi),誘導(dǎo)過程pH及誘導(dǎo)結(jié)果均接近,為使得藻液充分混合,0.2 vvm的通氣量較為合適。(3)轉(zhuǎn)光誘導(dǎo)前對(duì)異養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行光適應(yīng)可以實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定高效的誘導(dǎo)：不同狀態(tài)異養(yǎng)細(xì)胞光誘導(dǎo)后的結(jié)果相差較大,越接近厚壁孢子態(tài)的細(xì)胞的誘導(dǎo)效果越差。針對(duì)這種差異性和不穩(wěn)定性,開展了對(duì)異養(yǎng)細(xì)胞光適應(yīng)的研究,結(jié)果表明：不經(jīng)過適應(yīng)直接轉(zhuǎn)入強(qiáng)光400 μmol photons m-2 s-1誘導(dǎo),則光漂白的細(xì)胞數(shù)目約占25%；適應(yīng)階段適宜的中低光強(qiáng)為100μmol photons m-2 s-1,通過光適應(yīng)能夠顯著減小由異養(yǎng)轉(zhuǎn)入光誘導(dǎo)時(shí)細(xì)胞的死亡率,表征光合性能的Fv/Fm值則由異養(yǎng)結(jié)束時(shí)的0.6升高到0.8,表明通過1天的光適應(yīng),胞內(nèi)的光合系統(tǒng)得到恢復(fù)。異養(yǎng)藻細(xì)胞轉(zhuǎn)入光誘導(dǎo)時(shí)其光合系統(tǒng)進(jìn)行了自我修復(fù),光合作用相關(guān)的D1蛋白等得以再生,其含量先逐步升高再降低；光合作用相關(guān)蛋白PsbO、PetC等的活性則逐步下降,表明在逆境的條件下,雨生紅球藻細(xì)胞具有自我防御能力,其通過促進(jìn)胞內(nèi)蝦青素的合成以抵御外界的脅迫條件；光適應(yīng)很好地解決了不同狀態(tài)異養(yǎng)細(xì)胞誘導(dǎo)結(jié)果不穩(wěn)定的問題。采用光適應(yīng)策略對(duì)異養(yǎng)得到的三種狀態(tài)細(xì)胞即綠色游動(dòng)細(xì)胞、不動(dòng)膠殼細(xì)胞及厚壁孢子細(xì)胞進(jìn)行了誘導(dǎo)結(jié)果的對(duì)比研究。(4)不同類型的反應(yīng)器中光誘導(dǎo)工藝的放大和優(yōu)化：2,000 L跑道池的誘導(dǎo)效果較好,其細(xì)胞干重產(chǎn)率比200 L跑道池和10,000 L跑道池分別高近32.6%與41%；細(xì)胞在300 L平板式反應(yīng)器中誘導(dǎo)約11天后的細(xì)胞干重與蝦青素含量比15 L平板式反應(yīng)器低了24.5%及16.82%,顯示出平板反應(yīng)器存在放大效應(yīng),但可以通過加內(nèi)部光源和全天候人工光照來解決,使得誘導(dǎo)效果與對(duì)照相當(dāng)；柱式反應(yīng)器放大后仍然較適合用于光誘導(dǎo),70L柱式的誘導(dǎo)效果僅比1L柱式低了3.9%。(5)誘導(dǎo)工藝在多地戶外條件下的驗(yàn)證及蝦青素產(chǎn)量與誘導(dǎo)光照總量、誘導(dǎo)平均溫度等理化因素之間模型的建立：對(duì)雨生紅球藻異養(yǎng)細(xì)胞光誘導(dǎo)高產(chǎn)蝦青素這一新模式的可行性,在不同氣候的多地戶外條件下進(jìn)行了驗(yàn)證；同時(shí)光照總量、平均溫度與蝦青素產(chǎn)量之間的關(guān)系研究表明：在整個(gè)誘導(dǎo)階段,蝦青素的體積產(chǎn)量與日光照總量之間符合Logistics關(guān)系；同時(shí)誘導(dǎo)的理論產(chǎn)量與誘導(dǎo)過程的平均溫度之間符合Gauss關(guān)系,其在平均溫度為22.7℃時(shí)候達(dá)到最大值,為準(zhǔn)確預(yù)測誘導(dǎo)誘導(dǎo)結(jié)果提供參考。綜上所述,對(duì)異養(yǎng)的條件優(yōu)化實(shí)現(xiàn)了雨生紅球藻的高效培養(yǎng),比較分析了異養(yǎng)細(xì)胞生化組成及光合系統(tǒng)差異后,優(yōu)化了異養(yǎng)轉(zhuǎn)光誘導(dǎo)的培養(yǎng)條件并針對(duì)性地提出了光適應(yīng)的策略,實(shí)現(xiàn)了異養(yǎng)的高效率與異養(yǎng)細(xì)胞光誘導(dǎo)產(chǎn)蝦青素的高效率兩者的統(tǒng)一；異養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)過光誘導(dǎo)產(chǎn)蝦青素的可行性在多地不同氣候條件下得到了驗(yàn)證,光誘導(dǎo)過程蝦青素積累與光照、溫度之間的模型隨之建立；最后對(duì)光誘導(dǎo)過程中的光生物反應(yīng)器進(jìn)行了初步研究,成功優(yōu)化并放大了光誘導(dǎo)工藝。本文的研究為雨生紅球藻異養(yǎng)細(xì)胞光誘導(dǎo)高產(chǎn)蝦青素這一新模式的產(chǎn)業(yè)化提供了重要的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：華東理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q949.2;TQ28

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本文編號(hào)：1303459