本文關(guān)鍵詞：微生物蛋白�；揎椗c合成代謝調(diào)控

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【摘要】：蛋白賴氨酸�；揎検且环N動(dòng)態(tài)可逆的翻譯后修飾,通過(guò)調(diào)控蛋白的活性,定位,以及蛋白間的相互作用來(lái)影響諸多生物過(guò)程。蛋白酰化修飾構(gòu)建了�；�-CoA代謝與胞內(nèi)信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)的關(guān)聯(lián)性。酰化修飾水平與細(xì)胞內(nèi)�；�-CoA的濃度與種類密切相關(guān),高濃度�；�-CoA的積累能通過(guò)酶催化與非酶催化的方式影響酰化修飾的程度,從而影響細(xì)胞內(nèi)多樣的生理功能。此外,�；�-CoA可以作為合成代謝產(chǎn)物的前體,用于不同類型產(chǎn)物的生物合成中。本文以多種微生物模型為研究對(duì)象,系統(tǒng)研究了蛋白酰化修飾的發(fā)生及動(dòng)態(tài)變化對(duì)合成代謝途徑中關(guān)鍵酶的反饋調(diào)控作用,同時(shí)也從代謝物影響�；揎椀慕嵌�,鑒定了一種受到氨基酸變構(gòu)調(diào)控的蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)。研究由以下四部分組成:(1)紅霉糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea)蛋白丙二酰化定性及定量研究:我們結(jié)合了高靈敏度的質(zhì)譜技術(shù)以及高親和性的賴氨酸丙二�；贵w富集技術(shù),對(duì)紅霉糖多孢菌中蛋白賴氨酸丙二酰化修飾底物進(jìn)行了鑒定。這是首次在原核生物中進(jìn)行蛋白丙二�；揎椊M學(xué)的報(bào)道。此外,我們結(jié)合生物信息學(xué)工具,進(jìn)行了修飾底物的功能定位,位點(diǎn)分析,相互作用分析等。并通過(guò)點(diǎn)突變分析模擬了賴氨酸丙二�；稽c(diǎn)對(duì)代謝酶的調(diào)控作用。此后,我們針對(duì)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期及平臺(tái)期S.erythraea菌的蛋白丙二酰化修飾進(jìn)行定量分析,揭示了不同生長(zhǎng)周期蛋白丙二�；揎椀膭�(dòng)態(tài)變化。在此基礎(chǔ)上,我們發(fā)現(xiàn)丙二酸鹽添加情況下,紅霉糖多孢菌和天藍(lán)色鏈霉菌(Streptomyces coelicolor)體內(nèi)賴氨酸丙二酰化修飾水平的差異。證明了細(xì)胞內(nèi)丙二酰-CoA的濃度影響了蛋白丙二�；男揎椝�,從而為蛋白酰化修飾與微生物合成代謝途徑關(guān)聯(lián)性的研究打下了基礎(chǔ)。(2)蛋白�；答佌{(diào)控機(jī)制對(duì)紅霉素合成的影響:通過(guò)定量蛋白酰化組學(xué)分析,我們發(fā)現(xiàn)S.erytraea菌的野生WT型相對(duì)于高產(chǎn)E3菌而言,在蛋白乙�；揎椪w水平?jīng)]有差異的情況下,丙�；揎椪w水平顯著提高。我們進(jìn)一步通過(guò)酶活分析,探究了蛋白丙酰化修飾對(duì)丙酰-CoA合成通路中丙二酸半醛脫氫酶(mmsA2)的抑制作用,揭示了在產(chǎn)物合成過(guò)程中,存在�；揎棇�(duì)合成途徑代謝酶的反饋調(diào)控。此后,我們?cè)诠I(yè)生產(chǎn)紅霉素的過(guò)程中,通過(guò)對(duì)不同濃度正丙醇添加后的紅霉素產(chǎn)量測(cè)定及丙酰化底物的分析,證明了蛋白丙�；揎椖軌蛲ㄟ^(guò)抑制丙醛脫氫酶以及SAM合成酶的活性,降低了紅霉素的產(chǎn)量。最后,我們?cè)赟.erythraea高產(chǎn)菌中過(guò)表達(dá)去酰基化酶,緩解了高正丙醇添加情況下的蛋白丙�；种谱饔谩Ｎ覀兊难芯渴状谓⒘说鞍柞；揎椗c微生物產(chǎn)物合成途徑的關(guān)聯(lián)性,擴(kuò)展了對(duì)蛋白�；揎椪{(diào)控廣泛性的認(rèn)知。(3)蛋白酰基化調(diào)控機(jī)制存在于多種以�；�-CoA為前體的產(chǎn)物合成中:我們首先證明了蛋白�；揎椃答佉种菩�(yīng)存在于以丙二酰-CoA為前體的十一烷基靈菌紅素的生物合成中,接著又證明了蛋白酰化修飾影響了能源類物質(zhì)丁醇的生物合成。在此基礎(chǔ)上,我們進(jìn)一步探討蛋白�；答佌{(diào)控效應(yīng)對(duì)以底盤(pán)大腸桿菌(Eschericia coli)細(xì)胞為合成工廠的人工構(gòu)建型的丙二酰-CoA依賴性赤松素合成途徑的影響。證明了蛋白丙二�；揎椖軌蛞种�4-對(duì)香豆酸連接酶(4CL)以及芪合成酶(STS)的活性,從而抑制赤松素的產(chǎn)量。最后,我們通過(guò)對(duì)丙二酰化修飾的賴氨酸位點(diǎn)改造為精氨酸的方式,避免了�；揎椀陌l(fā)生,一定程度上解除了賴氨酸丙二�；囊种谱饔�,提高了赤松素的產(chǎn)量。該研究證明酰基-CoA前體量的增加能夠提高產(chǎn)物產(chǎn)量的同時(shí),也增加了賴氨酸�；揎椀乃�,并對(duì)產(chǎn)物合成途徑產(chǎn)生抑制作用。這是細(xì)胞針對(duì)內(nèi)源性及外源性產(chǎn)物合成途徑做出的反饋調(diào)控機(jī)制,涉及到不同類型產(chǎn)物的生物合成中。(4)基于代謝物變構(gòu)調(diào)控的乙酰轉(zhuǎn)移酶功能研究:在研究蛋白�；揎椨绊懘x途徑的基礎(chǔ)上,我們同時(shí)探究代謝物對(duì)�；揎椣到y(tǒng)的調(diào)控作用。我們發(fā)現(xiàn)桔橙小單孢菌(Micromonosporaaurantiaca)菌中包含一種同時(shí)含有ACT結(jié)構(gòu)域和GNAT結(jié)構(gòu)域的蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶MaKat。通過(guò)FRET實(shí)驗(yàn),我們證明Cys和Arg可能與ACT結(jié)構(gòu)域相互作用并引起構(gòu)象的變化。此后,我們進(jìn)一步證明Cys和Arg可以提高M(jìn)aKat的活性,并提升底物乙酰-CoA合成酶MaAcs的乙酰化水平,即證明MaKat是一種氨基酸調(diào)控型乙酰轉(zhuǎn)移酶。這種新型乙酰轉(zhuǎn)移酶的發(fā)現(xiàn),表明放線菌中蛋白的乙酰化水平以及乙酰轉(zhuǎn)移酶的活性可能與細(xì)胞內(nèi)氨基酸的濃度密切相關(guān)。該研究不僅豐富了我們對(duì)原核生物蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶家族的認(rèn)知,同時(shí)也為代謝產(chǎn)物作用于�；揎椣到y(tǒng)的研究打下了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：華東理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：Q78
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本文編號(hào)：1293770