本文關鍵詞：玉米冷響應相關基因的克隆、功能鑒定及定量蛋白質組學研究

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【摘要】：非生物脅迫,如低溫、干旱和鹽脅迫等嚴重限制了植物的生長與產量。其中低溫影響植物的生長、發(fā)育、空間分布和作物產量。許多重要的糧食作物,如玉米、水稻、大豆、番茄等,對冷比較敏感,冷適應性差。中國東北地區(qū)是玉米的主要產區(qū),由于地理條件等因素,春季經常遭受冷害的侵襲,導致玉米大面積減產。隨著玉米需求量的不斷擴大,如何提高玉米的綜合產量成為當務之急。傳統(tǒng)育種和分子標記輔助的有效結合能夠選育出抗逆和廣泛適應性的玉米新品種。為了挖掘參與低溫響應的潛在基因和揭示逆境響應機制,本研究以玉米抗冷自交系W9816為實驗材料,選取三葉期的葉片和根部組織,采用c DNA-AFLP(c DNA amplified fragments length polymorphism)的方法,利用174對引物組合,比較低溫處理前后基因的差異表達情況。根據(jù)c DNA-AFLP分析,葉片中發(fā)現(xiàn)6829條TDFs(Transcript-derived fragments),根部6955條TDFs。每對引物組合30-50個AFLP擴增帶,其大小介于70-600 bp之間。盡管大多數(shù)條帶在冷脅迫后沒有發(fā)生明顯變化,但在葉片中仍然檢測到620個差異表達基因(Differentially expressed genes,DEGs),根部531個DEGs。這些差異表達基因顯示出不同的表達模式。其中,僅61個上調的DEGs和32個下調的DEGs在兩種組織中同時具有一致的表達趨勢。大多數(shù)DEGs冷脅迫后在兩種組織中體現(xiàn)出不同的表達趨勢。通過NCBI BLASTX和Maize GDB數(shù)據(jù)庫分析,根據(jù)其功能將差異表達基因分為5類:信號轉導(10,15%)、轉錄調控(9,13%)、翻譯和翻譯后修飾(10,15%)、細胞代謝與組織(24,36%),6個DEGs推測為編碼蛋白(9%),8個DEGs在數(shù)據(jù)庫中沒有匹配(12%)。利用q RT-PCR的方法驗證了16個玉米抗冷相關的候選基因。Sec14-like蛋白參與必要的生物學過程,例如磷脂代謝、信號轉導、膜運輸以及逆境響應。本研究采用RACE(Rapid amplification of c DNA ends)PCR的方法首次成功克隆了一個磷脂酰肌醇轉運相關蛋白Zm SEC14p(accession no.KT932998)。Zm SEC14p基因全長包括一個完整的開放閱讀框,推測編碼295個氨基酸。染色體定位表明Zm SEC14p基因定位于玉米基因組1號染色體上,橫跨3420 bp,包括5個外顯子。多重序列比對表明玉米Zm SEC14p與高粱Sb SEC14p氨基酸同源性最高;進化樹分析表明Zm SEC14p屬于UCSH的一個成員,僅僅包含一個SEC14 domain。I-TASSER結構預測表明Zm SEC14p蛋白包括10個α螺旋、5個β折疊、3個310螺旋,其中,7個α螺旋、5個β折疊以及2個310螺旋可形成磷脂結合口袋。基因表達模式研究發(fā)現(xiàn),Zm SEC14p基因轉錄受低溫、鹽以及ABA誘導表達;組織特異性分析表明Zm SEC14p在玉米葉片中表達最高。亞細胞定位表明Zm SEC14p蛋白主要定位于細胞核。對過表達Zm SEC14p轉基因擬南芥植株在不同生長發(fā)育時期抗逆表型鑒定發(fā)現(xiàn):在種子萌發(fā)階段,轉基因植株能夠顯著降低對低溫的敏感性,提高了對Na Cl和ABA的敏感性;在苗期,轉基因植株在低溫脅迫下具有更快的初生根生長速率;對生殖生長發(fā)育時期Zm SEC14p轉基因株系的抗冷表型鑒定結果表明,轉基因株系較野生型株系存活率提高了約38%�；钚匝踅M織定位以及抗氧化酶(SOD、POD)活性測定實驗表明,低溫脅迫后,相比于野生型株系,轉基因株系能夠顯著提高POD和SOD抗氧化酶的活性,酶活的提高與Zm SEC14p調控抗氧化相關基因的表達有關。脯氨酸含量測定實驗表明,低溫處理48 h后,Zm SEC14p轉基因株系的脯氨酸含量分別是野生型的1.35和1.61倍。低溫脅迫下,轉基因擬南芥中一些逆境脅迫應答基因(如CBF3、COR6.6、RD29B)的表達量較野生型顯著上調。上調表達的逆境響應基因推測與Zm SEC14p調節(jié)磷脂酶C(PLC)基因的表達與酶的活性相關。利用i TRAQ(Isobaric tags for relative and absolute quantification)定量蛋白質組學方法比較低溫處理前后玉米葉片蛋白質豐度變化情況。實驗結果表明低溫脅迫共鑒定到173個差異豐度蛋白(Differential abundance protein species,DAPS)。這些DAPS被分為以下功能類別:碳和能量代謝(38,22.0%)、轉錄后調節(jié)(13,7.51%)、翻譯、核糖體的結構與合成(15,8.67%)、翻譯后修飾、蛋白折疊與分子伴侶(14,8.09%)、氨基酸轉運和代謝(13,7.51%)、逆境響應(12,6.94%)、信號轉導(9,5.20%)、脂類代謝(5,2.90%)、次生代謝的生物合成(6,3.47%)、無機離子的轉運和代謝(2,1.16%)、復制、重組和修復(2,1.16%)、其它生物學過程(22,12.71%)和未知生物學過程(22,12.71%)。生物信息分析表明159個DAPS被注釋到38個GO(Gene Ontology)功能組;108個DAPS被分為20個COG(Clusters of Orthologous Groups of proteins)類別;99個DAPS參與60個KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)代謝通路�？寡趸瘜嶒炞C明了i TRAQ實驗結果的可靠性。轉錄譜與蛋白譜的關聯(lián)分析表明低溫脅迫玉米葉片中存在轉錄后調節(jié)和翻譯后修飾等過程。基于蛋白的功能性分析,玉米苗期低溫脅迫響應的適應性機制可能包括緩解由于葉綠體膜能量過剩引起的光損傷;通過糖酵解產生更多的能量;增加逆境響應蛋白的豐度;提高清除ROS的整體能力。轉錄后調節(jié)和翻譯后修飾在玉米低溫脅迫響應中也扮演重要的角色。目前還未見到有關玉米苗期低溫脅迫蛋白質豐度變化的研究報道。綜合以上研究表明,Zm SEC14p作為逆境脅迫響應基因在逆境調控網絡中起正向調控作用,同時,本研究從轉錄水平、蛋白質水平進行研究,增加了對玉米冷響應機制的理解,為今后通過基因工程改良玉米抗逆性提供了重要的候選基因。
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S513;Q943.2
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本文編號：1292402