本文關(guān)鍵詞：植物PG基因進化的研究與白菜雄蕊發(fā)育相關(guān)的兩個PG基因的表達分析和功能鑒定

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【摘要】：被子植物的花通常由雌蕊、雄蕊、花瓣和萼片四輪花器官組成,其中雄蕊和雌蕊的精確發(fā)育決定了植物的育性。雄蕊發(fā)育涉及一系列以細胞壁的降解和松弛為前提的細胞擴張與細胞分離事件。果膠是雙子葉植物初生細胞壁的主要成分,同時也是花粉內(nèi)壁和花粉管壁的重要組成成分。果膠的合成和降解涉及一系列酶的參與。多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonases, PGs)是重要的果膠水解酶之一,它參與到了果實成熟、器官脫落、花粉成熟等過程,對植物的生長發(fā)育具有重要意義。PG屬于植物最大的水解酶家族之一。然而,至今人們對PG家族的科學(xué)分類仍缺乏共識,對禾本科和雙子葉植物中PG家族結(jié)構(gòu)上的差異的根本原因仍不清楚。激素能調(diào)控雄蕊發(fā)育,那么雄蕊發(fā)育相關(guān)的PG基因是否受到了激素的調(diào)控表達,受到哪些植物激素的影響?這些問題都值得我們探討。此外,目前對PG基因在雄蕊發(fā)育過程中的功能鑒定的研究仍非常有限,需要我們進一步挖掘更多與雄蕊發(fā)育密切相關(guān)的PG基因,并鑒定其功能。本研究針對以上問題,分析了白菜PG基因家族成員的進化,比較了PG基因在禾本科和雙子葉植物間進化和表達的異同,篩選了與雄蕊發(fā)育相關(guān)的擬南芥PG基因,并研究了它們在雄蕊發(fā)育過程中的表達動態(tài)及其受植物激素的影響,分析了白菜兩個雄蕊發(fā)育相關(guān)PG基因的表達和生物學(xué)功能。主要研究結(jié)果與結(jié)論如下：(1)通過鄰接法對包括白菜在內(nèi)的5個陸生植物物種的269個PG基因構(gòu)建聯(lián)合系統(tǒng)發(fā)生樹,并進一步統(tǒng)計分析不同分枝PG的基因序列特征,估算PG基因編碼序列的進化速率、啟動子變異以及該兩者的相關(guān)性,結(jié)果表明,植物PG家族能被劃分為7類,不同類別PG基因在序列特征、進化速率、啟動子變異有其分支特異性。對啟動子變異與編碼序列進化速率的回歸分析結(jié)果表明,啟動子的進化與基因編碼序列的進化密切相關(guān)。不同于其他分支成員,Clade A和CladeE的蛋白進化較慢、啟動子變異卻很大,傾向于遍在表達,它們可能具有古老的起源。對白菜PG基因按照表達模式進行聚類后,我們發(fā)現(xiàn),不同分支成員在表達上存在偏向性,其中,Clade C、D和F傾向于在生殖器官中表達,對植物生殖發(fā)育具有重要意義。此外,表達分析結(jié)果也暗示劑量效應(yīng)是白菜重復(fù)PG基因保留的主要原因。(2)通過比較氨基酸序列相似性和分析保守結(jié)構(gòu)域,在5種禾本科植物(二穗短柄草、谷子、高粱、水稻和玉米)和5種雙子葉植物(擬南芥、大豆、苜蓿、楊樹和蓖麻)中一共鑒定出577個PG基因。進化分析結(jié)果顯示,禾本科和雙子葉植物的PG基因家族在基因重重和丟失模式以及進化速率上存在明顯差異。禾本科植物Clade C和Clade F的PG基因的數(shù)量明顯少于雙子葉植物。我們發(fā)現(xiàn)造成這種差異的主要原因是禾本科植物PG家族整體經(jīng)歷了較少的基因重復(fù)和較多的基因丟失。不論是在雙子葉植物還是禾本科植物中,Clade D和Clade E都發(fā)生了較其他大部分分支多的基因重復(fù)。利用已有的基因芯片數(shù)據(jù),我們對大豆、苜蓿、水稻、玉米和楊樹PG家族成員的表達分析結(jié)果顯示,在這兩大類物種中,Clade E成員都具有整體較高的表達量、并在各個組織遍在表達,而Clade D的成員可能與雄性生殖密切相關(guān),表明它們的功能在禾本科和雙子葉植物中都非常保守。Clade C和Clade F成員除了可能在兩類物種的生殖發(fā)育中發(fā)揮作用外,它們還可能特異地在雙子葉植物根的發(fā)育中扮演重要角色。(3)基于擬南芥芯片數(shù)據(jù),篩選出14個雄蕊發(fā)育相關(guān)的PG基因。系統(tǒng)發(fā)生分析結(jié)果表明,雄蕊發(fā)育相關(guān)的PG基因中絕大多數(shù)屬于PG家族的Clade D,還有來自除Clade A以外的其他分支的成員。對該14個PG基因啟動子元件的分析結(jié)果表明,這些基因可能主要受到生長素和赤霉素的調(diào)控表達。進一步構(gòu)建這14個基因的啟動子-GUS融合表達載體并轉(zhuǎn)化擬南芥。對篩選獲得的陽性轉(zhuǎn)化株的組織化學(xué)染色分析結(jié)果顯示,絕大多數(shù)雄蕊發(fā)育相關(guān)PG基因都在絨氈層和成熟花粉粒中表達。對經(jīng)過赤霉素或生長素處理的擬南芥轉(zhuǎn)化株幼苗的觀察結(jié)果表明,赤霉素和生長素能夠調(diào)控雄蕊發(fā)育相關(guān)PG基因在幼苗中的表達。(4)基于大白菜數(shù)據(jù)庫BRAD的基因組信息,通過克隆得到BrPG22-1和BrPG22-2的DNA和cDNA全長。序列比對分析結(jié)果顯示,BrPG22-1和BrPG22-2的氨基酸序列相似性高達92.0%�？缒そY(jié)構(gòu)域預(yù)測和亞細胞定位分析結(jié)果表明,該兩個基因是典型的分泌蛋白。半定量和啟動子-GUS融合表達系統(tǒng)的分析結(jié)果顯示,BrPG22-1和BrPG22-2主要在早期的雄蕊中表達,BrPG22-1還在花絲和胚囊中表達,表明BrPG22-1可能經(jīng)歷了新功能化。通過反義RNA技術(shù)抑制該兩個基因的表達后,轉(zhuǎn)基因植株的花器官形態(tài)、花粉形態(tài)和花粉活力與對照株相比沒有明顯差異,表明可能存在其他PG基因與BrPG22-1和BrPG22-2功能冗余。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：Q943.2
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本文編號：1285053