本文關(guān)鍵詞：拘束應(yīng)激增加小鼠流感病毒易感性機(jī)制研究及小分子活性肽Carnosine的干預(yù)作用

  更多相關(guān)文章： 拘束應(yīng)激 皮質(zhì)酮 Mfn2 流感病毒 MAVS Carnosine

【摘要】：除了病毒本身的因素外,宿主自身的易感性在流感疾病的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)病原體感染機(jī)體時(shí),機(jī)體主要通過(guò)直接抗病毒作用與增強(qiáng)機(jī)體對(duì)病原體的耐受能力發(fā)揮自我保護(hù)作用。當(dāng)機(jī)體無(wú)法有效發(fā)揮這兩種作用,會(huì)引起嚴(yán)重感染導(dǎo)致死亡,被稱(chēng)為流感的“易感個(gè)體”。研究表明新生兒、老年人、患有基礎(chǔ)代謝疾病及疲倦或應(yīng)激負(fù)荷下的人群屬于感染流感病毒的“易感人群”,且這部分人群感染流感后死亡率顯著升高,但關(guān)于這些因素是如何增加機(jī)體“易感性”的機(jī)理尚不明確。因此,深入研究流感“易感性”形成機(jī)制及如何降低機(jī)體“易感性”在防治流感病毒感染中具有重要意義。應(yīng)激負(fù)荷能激活下丘腦-垂體-腎上腺(Hypothalamic pituitaryadrenal,HPA)軸增加糖皮質(zhì)激素皮質(zhì)酮(Cortisostone,CORT)的分泌,同時(shí)CORT能夠調(diào)控先天性免疫反應(yīng)保護(hù)機(jī)體抵御病原體感染。前期研究發(fā)現(xiàn)拘束應(yīng)激負(fù)荷能增加小鼠對(duì)流感病毒的易感性。因此,本課題以拘束應(yīng)激負(fù)荷與CORT負(fù)荷建立小鼠與細(xì)胞“易感性”模型,探索CORT在拘束應(yīng)激負(fù)荷增強(qiáng)機(jī)體流感“易感性”的作用及機(jī)制。首先,本論文研究了拘束應(yīng)激負(fù)荷誘導(dǎo)的應(yīng)激激素CORT對(duì)小鼠流感病毒“易感性”的影響。將小鼠放置于50mL通風(fēng)良好的離心管中拘束負(fù)荷18 h,小鼠于給藥前1 d開(kāi)始拘束負(fù)荷,拘束應(yīng)激負(fù)荷18 h后第3 d以2×LD50的H1N1病毒經(jīng)滴鼻感染小鼠,實(shí)驗(yàn)組小鼠于拘束負(fù)荷后開(kāi)始每天皮下注射1 mg/kgCORT或25 mg/kg米非司酮(Mifepristone,RU486),連續(xù)給藥3 d,正常對(duì)照組、病毒組和拘束病毒模型組小鼠給予等量溶劑聚乙二醇(Polyethylene glycol,PEG)。感染流感病毒后連續(xù)觀察21d或者4d,檢測(cè)小鼠感染流感病毒后的發(fā)病率、死亡率與肺組織中的病毒量(Nuclear protein,NP)變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,拘束應(yīng)激負(fù)荷小鼠與CORT負(fù)荷小鼠感染流感病毒后發(fā)病率、死亡率明顯升高,肺組織中的病毒復(fù)制水平(NP蛋白表達(dá))明顯增加,且肺部病理?yè)p傷顯著加劇,而皮質(zhì)酮受體抑制劑RU486能夠改善上述過(guò)程。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,應(yīng)激激素CORT增強(qiáng)了小鼠對(duì)流感病毒“易感性”。其次,研究應(yīng)激激素CORT對(duì)線粒體抗病毒信號(hào)蛋白(Mitochondrial antiviral signaling protein,MAVS)通路的影響。病毒感染機(jī)體時(shí),體內(nèi)的MAVS被激活形成多聚體,mavs聚集體激活irf3與nf-κb誘導(dǎo)產(chǎn)生大量i型干擾素(interferon-i,ifn-i)與抗病毒蛋白(antiviralprotein,avp)從而抑制病毒的感染。本實(shí)驗(yàn)探討了拘束應(yīng)激負(fù)荷增加小鼠流感病毒“易感性”是否與應(yīng)激誘導(dǎo)的cort調(diào)控mavs抗病毒信號(hào)通路活性有關(guān)。將昆明種(km)小鼠隨機(jī)分為以下4組:正常對(duì)照組(control),病毒組(virus),拘束病毒模型組(stress+virus),ru486組(stress+virus+ru486)。小鼠于給藥前1d開(kāi)始拘束負(fù)荷,拘束負(fù)荷18h后第3d以2×ld50的h1n1病毒感染機(jī)體,實(shí)驗(yàn)組小鼠于拘束負(fù)荷后開(kāi)始每天皮下注射25mg/kgru486,連續(xù)給藥3d,正常對(duì)照組、病毒組和拘束病毒模型組給予等量溶劑peg。將小鼠于感染病毒后的第4d處死取肺組織,檢測(cè)肺組織中mavs及mavs聚集體蛋白表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,病毒感染增強(qiáng)了小鼠肺組織中mavs及mavs聚集體蛋白表達(dá);與病毒組相比,拘束病毒模型組小鼠肺組織中的mavs及mavs聚集體蛋白表達(dá)顯著下降,ru486上調(diào)了兩者蛋白表達(dá)。以上結(jié)果說(shuō)明應(yīng)激激素cort能夠通過(guò)抑制mavs蛋白及活性,降低機(jī)體抗病毒信號(hào)。mavs活化能夠促進(jìn)irf3磷酸化與nf-κb活化,從而調(diào)控ifn-β應(yīng)答。為了進(jìn)一步考察應(yīng)激誘導(dǎo)的cort降低ifn-β應(yīng)答提高小鼠流感“易感性”是否受nf-κb調(diào)控,本研究采用nf-κb抑制劑bay11-7082探討n(yōu)f-κb信號(hào)通路在cort負(fù)荷a549細(xì)胞感染流感后對(duì)ifn-β的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與單獨(dú)cort負(fù)荷細(xì)胞相比,cort負(fù)荷的a549細(xì)胞感染流感病毒后nf-κb蛋白表達(dá)增強(qiáng),誘導(dǎo)炎癥因子(tnf-α與il-6)釋放增加;與cort病毒模型組細(xì)胞相比,nf-κb抑制劑bay11-7082顯著降低了細(xì)胞中nf-κb表達(dá)水平,同時(shí)tnf-α與il-6釋放減少,提示cort能直接激活體內(nèi)的nf-κb信號(hào)誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)。但是bay11-7082對(duì)cort負(fù)荷的a549細(xì)胞感染流感病毒后np與ifn-β表達(dá)無(wú)影響,說(shuō)明細(xì)胞中ifn-β應(yīng)答受mavs調(diào)控而與nf-κb信號(hào)通路無(wú)關(guān)。以上結(jié)果表明拘束應(yīng)激負(fù)荷誘導(dǎo)的應(yīng)激激素cort一方面抑制了mavs抗病毒信號(hào)通路減少ifn-β應(yīng)答,另一方面直接激活nf-κb信號(hào)通路誘導(dǎo)了炎癥因子釋放,兩者共同作用提高了機(jī)體流感“易感性”。再次,mavs抗病毒信號(hào)減弱是拘束應(yīng)激負(fù)荷誘導(dǎo)應(yīng)激激素cort降低流感病毒“易感性”的重要機(jī)制。流感病毒能利用蛋白泛素化途徑調(diào)控機(jī)體先天性免疫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),而線粒體融合蛋白2(mitofusin2,mfn2)能夠抑制mavs抗病毒信號(hào)降低ifn應(yīng)答促進(jìn)病毒感染。因此,本課題從拘束應(yīng)激負(fù)荷與cort負(fù)荷對(duì)小鼠基因表達(dá)譜的影響,與體內(nèi)mavs泛素化角度研究和探討mfn2在應(yīng)激激素cort調(diào)控mavs泛素化中的作用。(1)首先采用小鼠表達(dá)譜測(cè)序?qū)惺鴳?yīng)激負(fù)荷與cort負(fù)荷小鼠進(jìn)行基因表達(dá)水平的檢測(cè),發(fā)現(xiàn)cort負(fù)荷能夠明顯上調(diào)小鼠肺組織中與先天性免疫及抗病毒相關(guān)的vdac1、irf3、mfn2與jun基因水平,其中mfn2基因水平顯著上調(diào),但是mavs基因水平無(wú)明顯影響,提示拘束應(yīng)激負(fù)荷與cort負(fù)荷增強(qiáng)機(jī)體易感性可能與mfn2有關(guān)。接下來(lái)采用rt-pcr與westernblot方法檢測(cè)拘束應(yīng)激負(fù)荷與cort負(fù)荷對(duì)小鼠與a549細(xì)胞中mfn2與mavs的基因與蛋白表達(dá)影響。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,cort負(fù)荷能增強(qiáng)mfn2基因與蛋白表達(dá),對(duì)mavs基因表達(dá)無(wú)影響,但是降低mavs蛋白表達(dá),提示mfn2可能與應(yīng)激激素cort提高機(jī)體流感“易感性”相關(guān)。(2)采用pires2-egfp-mfn2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染a549細(xì)胞,探討過(guò)表達(dá)mfn2對(duì)流感感染機(jī)體“易感性”的影響。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的a549細(xì)胞經(jīng)cort負(fù)荷后感染h1n1病毒,觀察細(xì)胞中np,ifn-β與ifitm3蛋白表達(dá)變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明過(guò)表達(dá)mfn2細(xì)胞感染流感病毒后np表達(dá)顯著增強(qiáng),ifn-β與ifitm3蛋白表達(dá)下降,說(shuō)明應(yīng)激激素cort上調(diào)了mfn2表達(dá)從而抑制了ifn-β應(yīng)答。(3)進(jìn)一步考察mfn2在cort調(diào)控mavs信號(hào)通路降低ifn-β應(yīng)答中的作用。采用免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,co-ip)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證mfn2與mavs在體內(nèi)相互作用,結(jié)果證明了mfn2與mavs在細(xì)胞體內(nèi)相互結(jié)合。采用co-ip與westernblot法相結(jié)合測(cè)定應(yīng)激激素cort對(duì)病毒感染小鼠肺組織中mavs泛素化的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與病毒組相比,拘束應(yīng)激負(fù)荷與cort負(fù)荷小鼠肺組織中mavs泛素化顯著增強(qiáng),以上結(jié)果提示mfn2可能通過(guò)促進(jìn)mavs泛素化抑制機(jī)體抗病毒信號(hào)通路。(4)采用pires2-egfp-mfn2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染a549細(xì)胞,觀察過(guò)表達(dá)mfn2對(duì)cort負(fù)荷a549細(xì)胞感染病毒后mavs泛素化的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,mfn2過(guò)表達(dá)促進(jìn)了a549細(xì)胞感染病毒后mavs泛素化,提示應(yīng)激激素cort通過(guò)上調(diào)mfn2促進(jìn)了mavs泛素化降解。最后,考察mfn2調(diào)控mavs信號(hào)通路在天然小分子活性肽肌肽(carnosine)保護(hù)拘束應(yīng)激負(fù)荷小鼠流感感染中的作用研究。課題組前期建立拘束負(fù)荷小鼠流感易感性模型,并用此模型評(píng)價(jià)出了許多天然產(chǎn)物對(duì)流感易感性的保護(hù)作用。其中,課題組前期研究發(fā)現(xiàn)天然小分子活性肽carnosine具有抗應(yīng)激與抗氧化等多種生理活性,且能夠提高流感感染小鼠的存活率,但是carnosine降低流感小鼠易感性是否與Mfn2調(diào)控MAVS信號(hào)通路有關(guān)尚未闡明。(1)采用拘束應(yīng)激負(fù)荷小鼠感染流感病毒,觀察流感小鼠肺指數(shù)、病毒復(fù)制及肺部病理?yè)p傷情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,carnosine顯著降低了拘束負(fù)荷小鼠感染流感病毒后的肺指數(shù)與病毒復(fù)制水平,減輕了肺部病理?yè)p傷。以上結(jié)果說(shuō)明小分子活性肽carnosine能夠?qū)α鞲懈腥镜膽?yīng)激負(fù)荷小鼠發(fā)揮保護(hù)作用。(2)探討carnosine降低拘束應(yīng)激負(fù)荷小鼠流感易感性是否與影響MAVS抗病毒信號(hào)通路有關(guān)。觀察應(yīng)激負(fù)荷小鼠感染流感后肺組織中IFN-β應(yīng)答與MAVS、p-IRF3、NF-κB與p-IκB蛋白表達(dá)變化情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與模型組相比,carnosine增強(qiáng)了流感小鼠肺組織中IFN-β與IFITM3蛋白表達(dá),上調(diào)了MAVS與p-IRF3蛋白表達(dá)水平,同時(shí)降低了NF-κB與p-IκB蛋白水平。以上結(jié)果說(shuō)明carnosine能夠激活MAVS抗病毒信號(hào)通路促進(jìn)IFN-β應(yīng)答從而降低機(jī)體流感易感性。(3)探討Mfn2調(diào)控MAVS抗病毒活性在carnosine降低機(jī)體流感易感性中的作用。觀察應(yīng)激負(fù)荷小鼠感染流感后肺組織中MAVS與MAVS聚集體及Mfn2蛋白表達(dá)變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與模型組相比,carnosine提高了流感小鼠肺組織中MAVS與MAVS聚集體蛋白表達(dá),降低了Mfn2蛋白表達(dá),說(shuō)明carnosine能通過(guò)Mfn2上調(diào)MAVS活性增強(qiáng)IFN應(yīng)答降低機(jī)體流感易感性。綜上所述,拘束應(yīng)激負(fù)荷增加小鼠對(duì)流感病毒的易感性是通過(guò)CORT上調(diào)Mfn2介導(dǎo)MAVS泛素化抑制IFN應(yīng)答。天然小分子活性肽carnosine通過(guò)下調(diào)Mfn2提高M(jìn)AVS介導(dǎo)的IFN應(yīng)答對(duì)流感感染應(yīng)激負(fù)荷小鼠發(fā)揮保護(hù)作用。
【學(xué)位授予單位】：暨南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R373.13

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 嚴(yán)燦,徐志偉,李艷,何彥麗,史亞飛,吳麗麗,王劍,潘毅;調(diào)肝健脾補(bǔ)腎方藥對(duì)反復(fù)心理應(yīng)激大鼠的中樞調(diào)整作用[J];廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào);2003年02期

，

本文編號(hào)：1283399