發(fā)布時(shí)間：2017-12-10 18:38

  本文關(guān)鍵詞：中間絲蛋白Nestin調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的作用機(jī)理研究

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【摘要】：細(xì)胞骨架是真核生物細(xì)胞中重要的蛋白纖維網(wǎng)架系統(tǒng),是細(xì)胞內(nèi)除了生物膜體系以及遺傳信息表達(dá)體系外的又一大非常重要的結(jié)構(gòu)體系,其主要包括三大類(lèi):微管、微絲、中間絲。它們不僅參與維持細(xì)胞的形態(tài)、保持細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)的有序性,還與細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)運(yùn)輸、分裂與分化、信號(hào)傳導(dǎo)與基因表達(dá)以及細(xì)胞運(yùn)動(dòng)等重要生命活動(dòng)密切相關(guān)。在這三類(lèi)骨架中,尤其以中間絲蛋白家族最為特殊,主要表現(xiàn)為:1.構(gòu)成微絲和微管的基本成分分別局限于肌動(dòng)蛋白和微管蛋白,而中間絲則可以由一個(gè)或多個(gè)不同的亞單位形成;2.中間絲蛋白是最穩(wěn)定的細(xì)胞骨架,也是三類(lèi)骨架纖維結(jié)構(gòu)中化學(xué)成分最為復(fù)雜的;3.微管和微絲作為細(xì)胞中重要的管家蛋白,對(duì)于細(xì)胞整個(gè)生命過(guò)程的結(jié)構(gòu)和功能的維持至關(guān)重要,相反,中間絲的表達(dá)則具有位置和時(shí)間的特異性。正因?yàn)槿绱?多數(shù)學(xué)者認(rèn)為中間絲蛋白的生物學(xué)功能遠(yuǎn)超出目前對(duì)于骨架蛋白功能的理解,而對(duì)其結(jié)構(gòu)和功能的深入探究將為我們解析不同來(lái)源以及不同階段的組織細(xì)胞生物學(xué)特征提供重要依據(jù)。在脊椎動(dòng)物中,中間絲蛋白家族根據(jù)其基因結(jié)構(gòu)和表達(dá)模式的不同被分為六大類(lèi),如:酸性角蛋白(I)、堿性角蛋白(II)、波形蛋白和結(jié)蛋白(III)、神經(jīng)絲(IV)、核纖層蛋白(V)、巢蛋白(Nestin)(VI)等。雖然中間絲蛋白種類(lèi)具有多樣性,但是其結(jié)構(gòu)卻有一定的共同點(diǎn):1.所有的中間絲蛋白質(zhì)都由頭部、桿狀區(qū)和尾部三個(gè)部分組成;2.其蛋白序列中間都有一段由310個(gè)氨基酸組成保守的以α-螺旋排列的超螺旋桿狀區(qū);3.蛋白序列的n端(頭部)和c端(尾部)都是非螺旋結(jié)構(gòu),在大小的氨基酸組成上有很大差異。已有研究表明,中間絲蛋白家族的不同結(jié)構(gòu)域與該蛋白的功能特點(diǎn)密切相關(guān)。例如:核纖層蛋l(fā)amins的n端和c端參與了其蛋白組裝過(guò)程,而中間桿狀區(qū)與c端則通過(guò)其中的入核序列(nls),指導(dǎo)lamins入核發(fā)揮功能;另一方面,角蛋白18(k18)能夠通過(guò)其n段結(jié)合14-3-3蛋白來(lái)調(diào)控肝細(xì)胞的有絲分裂進(jìn)程,且ser33位點(diǎn)的磷酸化對(duì)于該結(jié)合過(guò)程至關(guān)重要。nestin作為第vi類(lèi)中間絲蛋白,c端較長(zhǎng),n端較短,其蛋白結(jié)構(gòu)的特殊性決定了nestin不能進(jìn)行自身組裝,必須與其它的中間絲蛋白(vimentin,α-internexin等)組裝成異源二聚體。小鼠nestin基因由4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子所組成,具有三個(gè)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。其中,第1個(gè)內(nèi)含子有肌肉細(xì)胞特異性的增強(qiáng)子活性,第2個(gè)內(nèi)含子則調(diào)控中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)前細(xì)胞表達(dá)。近年來(lái)多項(xiàng)研究顯示,nestin基因的轉(zhuǎn)錄可被多種轉(zhuǎn)錄因子激活,如sp1和sp3。在胚胎發(fā)育時(shí)期,nestin最早表達(dá)在具有多向分化潛能的神經(jīng)上皮干細(xì)胞中,隨著細(xì)胞不斷分化,其表達(dá)呈下調(diào)趨勢(shì),并在分化完成后消失。除此之外,在胚胎發(fā)育早期新生血管過(guò)程中,nestin也被檢測(cè)到在內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá),其表達(dá)也會(huì)隨著血管的成熟而不斷下調(diào)。而在成體組織內(nèi),中間絲蛋白nestin僅在未完全分化、保持一定增殖能力的成體干/祖細(xì)胞群體中表達(dá)。因此,這類(lèi)nestin+細(xì)胞是成體干細(xì)胞池重要的組成部分,在維持機(jī)體干細(xì)胞池穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。近期,mendez-ferrer等人利用nestin-gfp轉(zhuǎn)基因小鼠首次證實(shí)了骨髓中存在一群nestin+細(xì)胞,并可在體外成克隆生長(zhǎng),具備成骨、成脂、成軟骨方向分化特性,提示中間絲蛋白nestin是骨髓間質(zhì)干細(xì)胞(mscs)的重要候選標(biāo)志。隨后,該研究小組進(jìn)一步證明,nestin+細(xì)胞可以分為nestin強(qiáng)陽(yáng)性(nestinbright+)與nestin弱陽(yáng)性(nestindim+)兩個(gè)細(xì)胞亞群,其中nestinbright+細(xì)胞參與維持小動(dòng)脈周?chē)脑煅杉?xì)胞的靜息狀態(tài);而nestindim+細(xì)胞則與髓竇處的造血干細(xì)胞的增殖、分化密切相關(guān)。這提示nestin不僅可以是骨髓原位mscs的重要標(biāo)志,還可能參與骨髓造血微環(huán)境的穩(wěn)定維持。那么,nestin能否成為其他組織來(lái)源的mscs的共同標(biāo)志呢?本課題組前期利用nestin-gfp轉(zhuǎn)基因小鼠研究發(fā)現(xiàn),從骨髓、睪丸、腎臟等多種組織中分離獲取的nestin+細(xì)胞,具有自我更新和多向分化的能力,證明了中間絲蛋白nestin是成體組織中間質(zhì)干細(xì)胞的特異標(biāo)志,為進(jìn)一步獲得適合損傷修復(fù)的間質(zhì)干細(xì)胞亞群提供了重要依據(jù)。另一方面,本實(shí)驗(yàn)室在國(guó)際上首次構(gòu)建了nestin基因敲除小鼠模型,發(fā)現(xiàn)nestin基因缺失可以引起神經(jīng)干細(xì)胞自我更新能力下降,細(xì)胞死亡顯著增加;同時(shí),nestin基因敲除后純合子小鼠在胚胎發(fā)育10.5天-11.5天死亡,其主要原因是胚胎卵黃囊的血管發(fā)育遲滯,血管周具有mscs特性的細(xì)胞死亡增加。此結(jié)果同樣表明中間絲蛋白nestin可能參與了機(jī)體mscs的自我更新與維持。因此,nestin不僅僅可以作為成體組織間質(zhì)干細(xì)胞的標(biāo)志物,還可能作為一種重要的功能蛋白參與組織干細(xì)胞池的穩(wěn)定和維持。除了正常狀況以外,中間絲蛋白nestin還可以在異常的組織細(xì)胞中表達(dá),包括一些損傷或者病變的組織。例如,脊髓損傷后的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞及室管膜細(xì)胞,視網(wǎng)膜中神經(jīng)損傷后的星形膠質(zhì)細(xì)胞等,中間絲蛋白nestin可以在損傷部位再次表達(dá),提示nestin可能參與了組織修復(fù)過(guò)程。此外,nestin也被發(fā)現(xiàn)在肝臟星形細(xì)胞中表達(dá),在肝臟發(fā)生纖維化的過(guò)程中,星形細(xì)胞大量增殖、激活,nestin+細(xì)胞數(shù)量也隨之升高。該結(jié)果同樣提示,nestin可能參與到肝纖維化進(jìn)程中。近年研究發(fā)現(xiàn),多種腫瘤組織可以檢測(cè)到中間絲蛋白nestin的表達(dá),如腦膠質(zhì)瘤、膀胱癌、肝癌、乳腺癌、肺癌和胰腺癌等,且nestin的表達(dá)與腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移等呈正相關(guān)。因此,中間絲蛋白nestin也被認(rèn)為是多種腫瘤干細(xì)胞的標(biāo)志物。課題組前期以非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株為模型探討n(yōu)estin在非小細(xì)胞肺癌中的作用及機(jī)制,發(fā)現(xiàn)nestin在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)與患者預(yù)后有關(guān),在多個(gè)肺癌細(xì)胞株下調(diào)nestin表達(dá)可導(dǎo)致細(xì)胞增殖減慢,細(xì)胞周期停滯于s期,磷酸化rb蛋白、磷酸化akt和磷酸化gsk3α/β表達(dá)減少,提示nestin通過(guò)akt-gsk3β-rb信號(hào)通路調(diào)控非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖。綜上所述,進(jìn)一步深入闡明中間絲蛋白nestin在不同類(lèi)型細(xì)胞中的作用機(jī)制,有助于揭示其在維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)中的重要作用�，F(xiàn)有研究顯示,中間絲蛋白作為細(xì)胞骨架的重要成分,其主要功能可能是作為細(xì)胞內(nèi)高度特異化的應(yīng)激蛋白,在多種應(yīng)激環(huán)境下發(fā)揮保護(hù)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的功能:1.凋亡壓力(apoptoticstress):細(xì)胞凋亡是機(jī)體維持自身穩(wěn)定的一種基本生理機(jī)制,處于極端環(huán)境中的細(xì)胞可通過(guò)這種自我犧牲的方式,來(lái)維持所在組織和器官的穩(wěn)態(tài)平衡。不同的細(xì)胞內(nèi)的多種中間絲蛋白都能夠發(fā)揮抗凋亡的作用,例如,角蛋白8和角蛋白18分別通過(guò)與腫瘤死亡因子受體2(tnfr2)和tnfr相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域(tradd)相結(jié)合、提高細(xì)胞外fasl受體的數(shù)量等多種方式發(fā)揮其抗凋亡功能;此外,小鼠心肌細(xì)胞敲除結(jié)蛋白(desmin)后可誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡,同時(shí)可以通過(guò)過(guò)表達(dá)抗凋亡蛋白(如:bcl-2)來(lái)緩解。2.氧化應(yīng)激(oxidantstress):活性氧(reactiveoxygenspecies,ros)是由機(jī)體內(nèi)部的代謝或外部的刺激所產(chǎn)生的一類(lèi)比分子氧(o2)的化學(xué)活性更活躍的含氧自由基。在細(xì)胞中,ros主要由線粒體以及nox蛋白家族產(chǎn)生,參與維持機(jī)體正常的生理功能。但是,當(dāng)機(jī)體發(fā)生異常時(shí),過(guò)量積累的ros則會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng),甚至損傷組織細(xì)胞。此時(shí),細(xì)胞就需要通過(guò)多種抗氧化物質(zhì)來(lái)維持其內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài),而在這一過(guò)程中,中間絲蛋白可能發(fā)揮著抗氧化應(yīng)激的重要作用。malhas等人把小鼠成纖維細(xì)胞內(nèi)的laminb1敲除后發(fā)現(xiàn),細(xì)胞內(nèi)的ros水平上升,并且對(duì)h2o2處理的敏感性增加,同時(shí),敲除大鼠神經(jīng)元前體細(xì)胞內(nèi)的中間絲蛋白nestin也會(huì)使h2o2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡大大增加,但是其中的具體機(jī)制仍未闡明。3.代謝壓力(metabolicstress):研究表明,多種中間絲蛋白可參與調(diào)控細(xì)胞的代謝過(guò)程,進(jìn)而發(fā)揮其重要的生物學(xué)功能。而與細(xì)胞代謝關(guān)系密切的多種細(xì)胞器中,最重要的就是線粒體。據(jù)報(bào)道,tao等人發(fā)現(xiàn),敲除了角蛋白8的小鼠肝細(xì)胞內(nèi)的線粒體明顯縮小,代謝功能發(fā)生改變。但是,中間絲是如何靶向細(xì)胞器的?其中的分子機(jī)制是什么?nestin作為重要的第vi類(lèi)中間絲蛋白,是否也參與了細(xì)胞器形態(tài)和功能的調(diào)節(jié)?同時(shí),中間絲蛋白nestin調(diào)節(jié)ros,維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的具體機(jī)制是什么?這些問(wèn)題都還有待進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期從事nestin蛋白功能的研究,前期研究表明中間絲蛋白nestin對(duì)于胚胎的發(fā)育至關(guān)重要,敲除nestin后純合子小鼠在胚胎發(fā)育早期死亡。與此一致的是,nestinko的胚胎干細(xì)胞(es)在體外分化形成胚體(eb)的過(guò)程中大量死亡。接著,我們通過(guò)加入多種程序性死亡抑制劑:z-vad-fmk(泛caspase凋亡抑制劑)、3-methyladenine(程序性自噬抑制劑)、nec1(程序性壞死抑制劑)后發(fā)現(xiàn),加入凋亡、程序性自噬的抑制劑并不能抑制nestinko小鼠eb細(xì)胞的死亡,而加入程序性壞死抑制劑后卻可以緩解這一現(xiàn)象。另一方面,程序性壞死的主要機(jī)制為rip1/rip3復(fù)合物促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)整體能量代謝水平,線粒體源性的ros水平升高,破壞細(xì)胞穩(wěn)態(tài),最終導(dǎo)致細(xì)胞壞死。提示nestinko的es分化過(guò)程中eb細(xì)胞的程序性壞死主要是細(xì)胞內(nèi)ros升高所導(dǎo)致。進(jìn)一步,通過(guò)加入ros抑制劑(nac等)發(fā)現(xiàn),nestinko導(dǎo)致的細(xì)胞死亡確實(shí)可以通過(guò)降低胞內(nèi)ros來(lái)緩解,但對(duì)于中間絲蛋白nestin如何影響細(xì)胞ros水平,進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的具體分子機(jī)制尚不明朗。另外,通過(guò)coip結(jié)合質(zhì)譜分析和超分辨顯微鏡等方法,觀察到中間絲蛋白nestin可以與細(xì)胞中多種功能蛋白相互結(jié)合,如熱休克蛋白家族(hspfamily),內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣atp酶(serca2),核纖層蛋白(lamina/c)等,有趣的是,通過(guò)進(jìn)一步生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),這些蛋白多數(shù)定位于細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)上,提示中間絲蛋白nestin可能參與維持細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)的穩(wěn)定。既然中間絲蛋白nestin可以與serca2,lamina/c等多種功能蛋白相互結(jié)合,那么中間絲蛋白nestin靶向內(nèi)膜系統(tǒng)的過(guò)程是否有以上功能蛋白的參與?他們之間的相互作用是否與內(nèi)膜系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)維持有關(guān)?同時(shí),nestin調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)ros的水平的分子機(jī)制尚不清楚,是通過(guò)從源頭減少ros的生成,例如調(diào)節(jié)線粒體代謝功能,還是通過(guò)提高細(xì)胞內(nèi)ros的清除速度,如調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的抗氧化體系來(lái)降低ros的水平呢?這些重要的科學(xué)問(wèn)題還有待進(jìn)一步研究,但都提示了中間絲蛋白nestin與細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)密切相關(guān)。因此,擬在前期工作基礎(chǔ)上,進(jìn)一步探究中間絲蛋白nestin調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的作用機(jī)理,本論文研究?jī)?nèi)容包括:第一部分:nestin參與細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)的穩(wěn)定維持第二部分:nestin通過(guò)影響線粒體動(dòng)力學(xué)調(diào)控細(xì)胞內(nèi)環(huán)境活性氧產(chǎn)生的分子機(jī)制第三部分:nestin通過(guò)保護(hù)nrf2蛋白穩(wěn)定性調(diào)控細(xì)胞內(nèi)環(huán)境抗氧化的分子機(jī)制第一部分nestin參與細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)的穩(wěn)定維持1.1目的本實(shí)驗(yàn)室前期利用coip-質(zhì)譜結(jié)合技術(shù)和超分辨顯微鏡技術(shù)得到多種可能與中間絲蛋白nestin相互作用的蛋白成分,進(jìn)一步分析提示中間絲蛋白nestin可能與多種膜性細(xì)胞器存在相互作用。因此,本部分研究擬對(duì)nestin的生物學(xué)功能及其對(duì)細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)的形態(tài)功能的影響進(jìn)行概括性初步探究。1.2方法1.2.1檢測(cè)nestin與線粒體的關(guān)系。在神經(jīng)干細(xì)胞nsc中,將nestin和coxiv免疫熒光染色,共聚焦顯微鏡下觀察,進(jìn)行共定位分析;分離線粒體部分提取蛋白質(zhì),通過(guò)westernblot檢測(cè)nestin蛋白的含量;構(gòu)建nsc的nestin干擾株,檢測(cè)干擾前后nsc的線粒體代謝功能。1.2.2檢測(cè)nestin對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞nsc增殖分化的影響。利用nsc的nestin干擾株,通過(guò)nestin與ki67免疫熒光染色,統(tǒng)計(jì)增殖細(xì)胞所占比例;通過(guò)成球培養(yǎng),檢測(cè)nsc的成球效率;不定向誘導(dǎo)nsc分化,tuj-1和gfap免疫熒光染色,統(tǒng)計(jì)nsc分化方向。1.2.3利用小鼠神經(jīng)干細(xì)胞系c17.2進(jìn)行serca2與nestin免疫熒光染色,以及coip實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證serca2與nestin蛋白間的關(guān)系。1.2.4檢測(cè)nestin與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的關(guān)系。利用nsc的nestin干擾株,利用er-tracker染色檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)改變,并且利用q-pcr檢測(cè)erstress水平。1.2.5檢測(cè)nestin與細(xì)胞核的關(guān)系。構(gòu)建肺癌細(xì)胞系a549和h1299的nestin干擾株,利用dapi對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行熒光染色,共聚焦顯微鏡下觀察,利用軟件分析細(xì)胞核圓度,并利用q-pcr,westernblot和免疫熒光染色檢測(cè)lamina/c和laminb的表達(dá)。1.2.6驗(yàn)證nestin與lamina/c蛋白間的關(guān)系。通過(guò)免疫熒光染色,核蛋白提取進(jìn)行westernblot,檢測(cè)nestin蛋白在細(xì)胞核是否有分布;通過(guò)coip實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證nestin與lamina/c是否存在相互結(jié)合。1.3結(jié)果1.3.1.nestin可以與線粒體相互結(jié)合,干擾nestin會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)線粒體代謝功能改變。1.3.2干擾nestin引起神經(jīng)干細(xì)胞增殖能力減弱,分化能力增強(qiáng)。1.3.3.nestin可以與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上serca2蛋白相互結(jié)合。1.3.4干擾nestin導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)改變,nestin表達(dá)下降過(guò)程中erstress水平升高。1.3.5干擾nestin導(dǎo)致細(xì)胞核畸形率增高,細(xì)胞核膜結(jié)構(gòu)松散。1.3.6.nestin可以入核與核骨架中l(wèi)amina/c相互結(jié)合。1.4結(jié)論1.4.1.nestin可以與線粒體結(jié)合并影響線粒體的代謝功能,進(jìn)而調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞的增殖及分化能力。1.4.2.nestin可以與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣泵serca2結(jié)合并影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的形態(tài)和功能。1.4.3.nestin可以入核并與核纖層蛋白lamina/c結(jié)合進(jìn)而影響核膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。第二部分nestin通過(guò)影響線粒體動(dòng)力學(xué)調(diào)控細(xì)胞內(nèi)環(huán)境活性氧產(chǎn)生的分子機(jī)制2.1目的前期的研究表明,中間絲蛋白Nestin可以與線粒體結(jié)合并影響線粒體的代謝功能。因此,本項(xiàng)目研究擬通過(guò)構(gòu)建穩(wěn)定干擾Nestin的腫瘤細(xì)胞系GIST-T1和GIST-882,深入探討Nestin影響線粒體的形態(tài)功能以及腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為的具體作用機(jī)理。2.2方法2.2.1檢測(cè)干擾Nestin對(duì)細(xì)胞ROS的影響。構(gòu)建胃腸間質(zhì)瘤(GIST)細(xì)胞系GIST-T1和GIST-882的Nestin干擾株,檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)總ROS,Nox蛋白家族產(chǎn)生的ROS以及線粒體來(lái)源的ROS的變化。2.2.2利用Mito-Tracker試劑對(duì)GIST細(xì)胞系線粒體進(jìn)行染色,通過(guò)共聚焦顯微鏡觀察,對(duì)比sh Nestin組與對(duì)照組線粒體的形態(tài)改變。2.2.3利用Q-PCR、Western blot、Co IP、免疫熒光染色和共聚焦顯微鏡觀察分析,從多個(gè)角度來(lái)檢測(cè)Nestin、線粒體動(dòng)力學(xué)相關(guān)蛋白、線粒體三者的關(guān)系。2.2.4檢測(cè)Nestin、Drp1與腫瘤增殖、遷移能力的關(guān)系。構(gòu)建可誘導(dǎo)干擾Nestin細(xì)胞系以及Drp1過(guò)表達(dá)GIST細(xì)胞系,通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)(劃痕實(shí)驗(yàn)、transwell遷移實(shí)驗(yàn))和小鼠體內(nèi)荷瘤實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)Nestin、Drp1是否與腫瘤增殖、遷移能力有關(guān)。2.2.5利用病人胃腸間質(zhì)瘤標(biāo)本,通過(guò)Western blot、IHC實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證Nestin表達(dá)量與腫瘤增殖、遷移能力的關(guān)系。2.3結(jié)果2.3.1干擾Nestin導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)總ROS水平下降,更進(jìn)一步的檢測(cè)提示,主要是由于線粒體來(lái)源的ROS水平下降。2.3.2干擾Nestin導(dǎo)致線粒體形態(tài)由點(diǎn)狀變?yōu)楣軤睢?.3.3.Nestin與線粒體分裂蛋白Drp1相互結(jié)合,干擾Nestin導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)線粒體上的Drp1蛋白減少,從而導(dǎo)致了線粒體形態(tài)的改變。2.3.4干擾Nestin導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞體外增殖、遷移能力下降,體內(nèi)成瘤性下降。2.3.5病人胃腸間質(zhì)瘤標(biāo)本中,Nestin表達(dá)量與腫瘤增殖、遷移能力呈正相關(guān)。2.4結(jié)論2.4.1中間絲Nestin參與調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境活性氧,在腫瘤細(xì)胞GIST中干擾Nestin后導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)總活性氧和線粒體來(lái)源的ROS下降。2.4.2干擾Nestin可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)線粒體形態(tài)由點(diǎn)狀向管狀變化。2.4.3中間絲蛋白Nestin與線粒體分裂蛋白Drp1在細(xì)胞內(nèi)相互結(jié)合,干擾Nestin會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)定位于線粒體上的Drp1減少,Nestin通過(guò)招募Drp1定位于線粒體上從而調(diào)控線粒體動(dòng)力學(xué)。2.4.4中間絲蛋白Nestin與胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為密切相關(guān),體內(nèi)和體外干擾Nestin都會(huì)引起腫瘤細(xì)胞增殖、遷移等能力下降。第三部分Nestin通過(guò)保護(hù)Nrf2蛋白穩(wěn)定性調(diào)控細(xì)胞內(nèi)環(huán)境抗氧化的分子機(jī)制3.1目的有文獻(xiàn)報(bào)道,干擾Nestin能加快H2O2誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞凋亡,過(guò)表達(dá)Nestin對(duì)H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作用,提示干擾Nestin后神經(jīng)干細(xì)胞抗氧化能力減弱。這意味著中間絲蛋白Nestin可能直接調(diào)控了細(xì)胞的抗氧化能力。因此,本項(xiàng)目研究擬通過(guò)構(gòu)建穩(wěn)定干擾Nestin的腫瘤細(xì)胞系A(chǔ)549和H1299,深入探討中間絲蛋白Nestin調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境抗氧化體系的具體分子機(jī)制。3.2方法3.2.1檢測(cè)Nestin與細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激敏感性的關(guān)系。構(gòu)建肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和H1299的Nestin干擾株,利用H2O2處理,然后進(jìn)行Annexin V/PI染色和死活試劑盒染色分析,對(duì)比sh Nestin組與對(duì)照組的細(xì)胞存活率和死亡率。3.2.2利用Q-PCR、GSH含量檢測(cè)試劑盒、SOD活性檢測(cè)試劑盒,以及Nrf2和Nestin免疫熒光染色后共聚焦顯微鏡觀察分析,檢測(cè)干擾Nestin后,肺癌細(xì)胞系抗氧化體系的變化。3.2.3添加蛋白合成抑制劑(CHX)和蛋白降解抑制劑(MG132)處理細(xì)胞,利用Western blot、Co IP實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證Nestin與Nrf-2蛋白間的關(guān)系。3.2.4利用Co IP和免疫熒光染色實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證Nestin、Nrf-2和Keap1蛋白間的關(guān)系。3.3結(jié)果3.3.1通過(guò)Annexin V/PI染色流式分析和死活試劑盒染色后共聚焦顯微鏡觀察分析發(fā)現(xiàn),干擾Nestin導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激的敏感性增加,細(xì)胞死亡增多。3.3.2對(duì)細(xì)胞抗氧化體系的檢測(cè)結(jié)果提示,干擾Nestin導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞抗氧化能力下降,并且Nrf2降解增多。3.3.3無(wú)論在正常狀態(tài)或是氧化應(yīng)激態(tài)下,干擾Nestin可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞Nrf2蛋白量減少,主要通過(guò)泛素-蛋白酶體降解途徑。3.3.4.Nestin可競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合Keap1來(lái)降低Nrf2降解水平。3.4結(jié)論3.4.1.Nestin與腫瘤細(xì)胞內(nèi)抗氧化能力直接相關(guān),干擾Nestin會(huì)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激敏感性增加,死亡增多。3.4.2干擾Nestin導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞抗氧化能力下降,且Nrf2降解增多,表明Nestin可通過(guò)Nrf2來(lái)調(diào)控腫瘤細(xì)胞的抗氧化能力。3.4.3干擾Nestin可使腫瘤細(xì)胞內(nèi)Nrf2的泛素化水平升高,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞內(nèi)Nrf2通過(guò)泛素-蛋白酶體途徑的降解。3.4.4.Nestin可通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合Keap1從而抑制Keap1對(duì)Nrf2結(jié)合以及進(jìn)一步的泛素化降解,從而穩(wěn)定Nrf2的蛋白水平,上調(diào)細(xì)胞的抗氧化體系。
【學(xué)位授予單位】：中山大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R329.2
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本文編號(hào)：1275514