本文關(guān)鍵詞：球擬假絲酵母Starmerella bombicola槐糖脂合成、代謝相關(guān)基因功能的研究

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【摘要】：表面活性劑是一種重要的化工原料,由于其具有能夠促進(jìn)物質(zhì)液化、乳化及化學(xué)分子的擴(kuò)散等性質(zhì),被廣泛應(yīng)用于化妝品、洗滌劑、食品、紡織品和藥品等工業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域；另外,由于其抗粘、消泡、防腐、抗靜電等物理化學(xué)性質(zhì),還被應(yīng)用在精細(xì)化工領(lǐng)域。但是由于化學(xué)表面活性劑生物降解性差、某些組分對(duì)環(huán)境有傷害等原因,相對(duì)低毒、對(duì)環(huán)境友好及生物降解性良好的生物表面活性劑逐漸引起人們的注意。在眾多不同種類生物表面活性劑中,槐糖脂是目前已知產(chǎn)量最高、被認(rèn)為最具發(fā)展?jié)摿�、將來有可能替代化學(xué)表面活性劑的生物表面活性劑。球擬假絲酵母是一類高產(chǎn)槐糖脂酵母菌,目前關(guān)于槐糖脂合成過程的研究已有不少報(bào)道,但是有關(guān)槐糖脂代謝及合成調(diào)控相關(guān)的研究還未見報(bào)道。另外,槐糖脂合成與脂肪酸(尤其是長(zhǎng)鏈脂肪酸)代謝的關(guān)系密切,但是有關(guān)產(chǎn)槐糖脂菌株是如何攝取外界環(huán)境中長(zhǎng)鏈脂肪酸的這一過程的研究鮮有報(bào)道。對(duì)于槐糖脂合成、代謝過程中關(guān)鍵酶及調(diào)控基因的研究將有助于在基因水平對(duì)槐糖脂生產(chǎn)菌株進(jìn)行遺傳改造,從而能夠獲得高產(chǎn)特定組分槐糖脂的工程菌株。基于此,本論文以槐糖脂產(chǎn)生菌球擬假絲酵母為研究對(duì)象,展開下列相關(guān)研究。主要研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下：1.槐糖脂代謝相關(guān)單加氧酶基因moA功能的研究本論文研究所用球擬假絲酵母Starmerella bombicola,是一類產(chǎn)槐糖脂酵母菌,由本實(shí)驗(yàn)室早期在含油污水中篩選得到,起初通過生理生化實(shí)驗(yàn)鑒定為擬威克酵母Wickerhamiella domercqiaevar. Sophorolipid。近期通過基因組序列分析,將該菌株重新歸類為球擬假絲酵母S. bombicola。球擬假絲酵母S. bombicola CGMCC 1576能夠發(fā)酵產(chǎn)生大量的槐糖脂,根據(jù)其結(jié)構(gòu)不同,所產(chǎn)槐糖脂主要分為內(nèi)酯型和酸型兩種類型。本研究發(fā)現(xiàn)在槐糖脂產(chǎn)生菌S. bombicola基因組中含有一個(gè)潛在的單加氧酶MoA,通過基因組注釋分析、蛋白模建及基因敲除等策略,發(fā)現(xiàn)其與特異槐糖脂組分-脂肪酸側(cè)鏈部分為C18:2的雙乙�；嵝突碧侵�(C18:2 DASL)的代謝有關(guān)。在敲除株△moA中,槐糖脂組分發(fā)生了明顯變化,HPLC色譜分析顯示,C18：2DASL組分含量由9.84×106 mAU×s提高到34.26×106 mAU×s,提高了248.17%。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),在MoA過表達(dá)菌株P(guān)eno::moA的發(fā)酵液中(以亞油酸和葡萄糖為底物)基本不含有槐糖脂組分C18：2 DASL。將單加氧酶蛋白MoA在大腸桿菌Escherichia coli JM109 (DE3)中進(jìn)行異源表達(dá),所用重組質(zhì)粒為pMAL-c2x-moA,得到的重組蛋白MoA能夠特異性降解C18：2 DASL槐糖脂組分,而不能降解C18:1DASL組分。2.長(zhǎng)鏈脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因alcs功能的研究一般認(rèn)為脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)主要分為兩種形式,即蛋白載體介導(dǎo)的運(yùn)輸和磷脂雙分子層的擴(kuò)散作用。目前,人們已發(fā)現(xiàn)三類與脂肪酸運(yùn)輸有關(guān)的膜蛋白,如：鼠脂肪細(xì)胞膜蛋白,脂肪酸轉(zhuǎn)位酶(FAT)；線粒體天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶類脂肪酸結(jié)合膜蛋白(FABPpm);3T3-L1脂肪細(xì)胞中的脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(FATP)。而槐糖脂產(chǎn)生菌株球擬假絲酵母S. bombicola具有利用胞外長(zhǎng)鏈脂肪酸合成槐糖脂的能力,但是脂肪酸是如何轉(zhuǎn)運(yùn)到胞內(nèi)的這一具體過程還不是很清楚。本研究發(fā)現(xiàn),在該槐糖脂產(chǎn)生菌中含有一個(gè)可能與長(zhǎng)鏈脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的膜結(jié)合蛋白,該蛋白基因編碼合成一個(gè)長(zhǎng)鏈酯酰-CoA合成酶(ALCS)。將該蛋白基因alcs敲除以后,敲除株在以長(zhǎng)鏈脂肪酸(比如C12：0,C14：0,C16：0,C18：0,C22：0或C24：0)為唯一碳源的基本培養(yǎng)基上幾乎不能生長(zhǎng),并且其轉(zhuǎn)運(yùn)含有熒光基團(tuán)的長(zhǎng)鏈脂肪酸類似物BODIPY-3823的能力明顯下降。基因alcs的缺失還能夠引起槐糖脂產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)變化,在alcs敲除株的發(fā)酵產(chǎn)物中基本沒有內(nèi)酯型槐糖脂生成,并且產(chǎn)生的酸型槐糖脂主要是由脂肪酸側(cè)鏈部分為中等碳鏈長(zhǎng)度的槐糖脂分子組成。為進(jìn)一步鑒定ALCS蛋白是否具有長(zhǎng)鏈酯酰-CoA的催化功能,將該蛋白在大腸桿菌JM109(DE3)中進(jìn)行異源表達(dá),得到的重組蛋白具有能夠催化長(zhǎng)鏈脂肪酸和CoA底物形成特異長(zhǎng)鏈酯酰-CoA的能力。3.槐糖脂合成相關(guān)調(diào)控蛋白基因功能的研究通過不同發(fā)酵條件下轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)分析,發(fā)現(xiàn)在以硫酸銨為氮源發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)酸型胞外蛋白酶AxpA轉(zhuǎn)錄明顯上調(diào),通過比對(duì)分析,在球擬假絲酵母基因組中找到其他三個(gè)同源蛋白AxpB、AxpC及AxpD,以潮霉素為篩選標(biāo)記對(duì)這四個(gè)蛋白進(jìn)行了共敲除,敲除株在以硫酸銨為氮源發(fā)酵條件下的酸型槐糖脂產(chǎn)量得到明顯提同。另外,通過生物信息學(xué)分析及遺傳操作,發(fā)現(xiàn)一個(gè)與槐糖脂合成、酸堿平衡調(diào)控及Ca離子耐受調(diào)控相關(guān)的蛋白PalA,對(duì)其功能進(jìn)行了初步探究,該蛋白編碼基因被敲除以后,缺失突變菌株對(duì)堿性環(huán)境、高鈣離子環(huán)境的耐受性下降,并且與槐糖脂合成相關(guān)的關(guān)鍵酶基因轉(zhuǎn)錄發(fā)生沉默。以綠色熒光蛋白EGFP為標(biāo)記,對(duì)該蛋白的細(xì)胞定位進(jìn)行了初步研究,發(fā)現(xiàn)該蛋白分布于細(xì)胞質(zhì)溶質(zhì)中。推測(cè)PalA蛋白可能是與槐糖脂合成調(diào)控相關(guān)的信號(hào)通路蛋白。4.通過RecET重組構(gòu)建槐糖脂高產(chǎn)菌株關(guān)于槐糖脂產(chǎn)生菌株的研究,目前已發(fā)現(xiàn)多個(gè)與槐糖脂合成相關(guān)的基因,如長(zhǎng)鏈脂肪酸末端或次末端羥基化酶(CYP52M1)、槐糖脂合成第一步UDP-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(UGTA1)、合成第二步UDP-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(UGTB1)、槐糖脂分子中槐糖羥基部位的乙�；D(zhuǎn)移酶(SLAT)、槐糖脂轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(MDR)以及酸型槐糖脂內(nèi)酯化酶(LIP1)等。在酵母菌S. bombicola中,與槐糖脂合成相關(guān)的這幾個(gè)酶的編碼基因,除lip1以外,全部分布在同一個(gè)基因簇上。隨著工業(yè)及醫(yī)藥領(lǐng)域?qū)碧侵男枨笕找嬖龃?構(gòu)建某些特定槐糖脂組分產(chǎn)量較高的工程菌株,變得越來越重要。在本論文中,基于以上理論基礎(chǔ),我們通過RecET重組系統(tǒng),構(gòu)建了含有雙拷貝槐糖脂合成基因簇的過表達(dá)菌株OE-5。經(jīng)蒽酮-硫酸法測(cè)定,過表達(dá)菌株總槐糖脂產(chǎn)量由56.9g/L提高到79.6g/L,提高了41.7%；內(nèi)酯型槐糖脂產(chǎn)量由23.1 g/L提高到36.4 g/L,提高了57.6%。高效液相色譜分析結(jié)果顯示,當(dāng)以油酸和葡萄糖為復(fù)合碳源進(jìn)行發(fā)酵時(shí),過表達(dá)菌株OE-5的各槐糖脂組分與野生型菌株類似,但是含量均高于野生型菌株；其中某些特定組分含量有顯著提高,如C18:2NASL含量提高了806.59%, C 18:2 DLSL含量提高了35.20%,C18:1 DLSL含量提高了62.52%。5.潮霉素抗性標(biāo)記自刪除系統(tǒng)構(gòu)建槐糖脂產(chǎn)生菌球擬假絲酵母S. bombicola對(duì)多種抗生素具有耐受性,如硫銨吡啶、博來霉素及G418等。在眾多抗生素中,潮霉素是迄今為止發(fā)現(xiàn)能夠有效抑制球擬假絲酵母生長(zhǎng)的抗生素。在現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道中,除了ura3營(yíng)養(yǎng)缺陷型,只有潮霉素抗性hph標(biāo)記被用來進(jìn)行球擬假絲酵母S. bombicola的遺傳改造。較少的遺傳操作篩選標(biāo)記限制了槐糖脂產(chǎn)生菌的多基因遺傳改造。本論文采用p-絲氨酸重組酶及誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(半乳糖激酶galk啟動(dòng)子),成功構(gòu)建了潮霉素抗性自刪除篩選系統(tǒng)。通過同源重組,被敲除基因編碼區(qū)被該篩選標(biāo)記取代后,所得到的轉(zhuǎn)化子在半乳糖誘導(dǎo)條件下,敲除株的抗性標(biāo)記發(fā)生自我剪切并丟失。最終獲得不含有任何抗性篩選標(biāo)記的敲除株。潮霉素抗性標(biāo)記自刪除系統(tǒng)的構(gòu)建實(shí)現(xiàn)了潮霉素抗性的循環(huán)利用,極大地方便了槐糖脂產(chǎn)生菌的多基因遺傳改造操作過程。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q936
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本文編號(hào)：1270050