發(fā)布時(shí)間：2017-12-09 02:24

  本文關(guān)鍵詞：體內(nèi)硝酸鹽、亞硝酸鹽分析新方法及其應(yīng)用研究

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【摘要】：一氧化氮(NO)是機(jī)體內(nèi)作用廣泛、性質(zhì)獨(dú)特的信號(hào)分子,也是一種新型的細(xì)胞間信息交換的重要載體。近年來,有關(guān)NO的生物學(xué)和病理學(xué)效應(yīng)的研究得到了迅速發(fā)展,已成為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)和前沿之一。NO作為一種新型的信使分子參與體內(nèi)多種主要生理功能,但它的生成過多或合成不足,卻是人類許多疾病的病因或主要促進(jìn)因素。體內(nèi)NO濃度已經(jīng)成為衡量人體健康與疾病狀態(tài)的重要指標(biāo)之一,因此生物體內(nèi)NO的檢測(cè)方法的研究及其應(yīng)用在臨床上具有重要意義。但由于NO化學(xué)性質(zhì)非�；顫�,在體內(nèi)的半衰期僅為3-5s,極易被氧化,直接測(cè)定難度較大。體內(nèi)硝酸鹽(NO3-)和亞硝酸鹽(NO2-)作為相對(duì)穩(wěn)定的NO代謝產(chǎn)物,引起越來越多的關(guān)注,大量研究表明可通過測(cè)定體液中的NO3-、NO2-的含量來間接反映體內(nèi)NO水平。然而由于生物樣品基質(zhì)復(fù)雜多樣,且生物體內(nèi)NO2-含量?jī)H為ng水平,遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于NO3-含量,檢測(cè)難度高于NO3-。因此針對(duì)目前生物樣品中NO3-、NO2-分析檢測(cè)存在的問題,建立新型檢測(cè)技術(shù)和樣品前處理技術(shù)顯得非常重要。采用建立的靈敏、高效的分析方法,研究在海拔及不同因素影響下生物體內(nèi)NO3-、NO2-的變化,為高原反應(yīng)評(píng)估奠定基礎(chǔ);為探討體內(nèi)NO3-、NO2-在高原低氧適應(yīng)中的可能機(jī)制提供依據(jù)。本論文主要研究?jī)?nèi)容如下:(1)采用反相離子對(duì)高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定血液、尿液中亞硝酸鹽(NO2-)和硝酸鹽(NO3-)。在弱酸性流動(dòng)相中離子對(duì)試劑四丁基氫氧化銨(TBAOH)與NO3-形成離子對(duì),檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm;NO2-通過重氮化偶合反應(yīng)生成偶氮化合物,檢測(cè)波長(zhǎng)為510 nm。由于兩種產(chǎn)物極性差異較大,避免了相互干擾。因此采用雙波長(zhǎng)檢測(cè)方法,在相同的色譜條件下同時(shí)測(cè)定兩種離子。在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下,NO3-和NO2-通過AgilentTC-C18色譜柱在12min內(nèi)得到完全分離。消除了生物樣品中常見離子和溶解性有機(jī)物對(duì)測(cè)定干擾的同時(shí),提高了 NO2-的檢測(cè)靈敏度。在最佳條件下,NO3-和NO2-分別在5-200μg/mL和10-1000ng/mL濃度范圍內(nèi)與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,檢測(cè)限分別為0.5 μg/mL和4.5 ng/mL,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.8-4.9%。該方法適用于生物樣品中NO3-和NO2-的同時(shí)測(cè)定,并具有較高的檢測(cè)靈敏度和精密度。(2)采用濁點(diǎn)萃取技術(shù)血漿和尿液中亞硝酸鹽(NO2-)衍生物進(jìn)行萃取,萃取物通過酶標(biāo)儀分光光度法進(jìn)行測(cè)定。該方法采用活性炭進(jìn)行尿液脫色,用硫酸鋅和氫氧化鈉對(duì)血漿進(jìn)行蛋白沉淀及脫色處理,去除樣品基體干擾。以非離子表面活性劑Triton X-114作為萃取劑,萃取樣品中NO2-偶氮化合物,用酶標(biāo)儀代替紫外可見分光光度計(jì),多個(gè)樣品可被同時(shí)測(cè)定。最優(yōu)萃取條件為4%(v/v)Triton又-114,0.2g(NH4)2SO4,3000rpm離心8min。在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下,NO2-在10-1000 ng/mL濃度范圍內(nèi)與吸光值呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,檢出限為2.5 ng/mL,回收率為90.5～95.9%,富集倍數(shù)可達(dá)24.5倍。與紫外可見分光光度法相比,酶標(biāo)法操作更為簡(jiǎn)便,表面活性劑富集相無(wú)須稀釋脫鹽處理,可在十幾秒內(nèi)完成數(shù)十個(gè)待測(cè)樣品的測(cè)定,具有明顯的優(yōu)勢(shì)。(3)采用分子熒光光譜法研究了亞硝酸鹽(NO2-)與鄰苯二胺(OPD)的衍生化反應(yīng)及形成的衍生物苯并三氮唑的熒光強(qiáng)度變化,應(yīng)用羥丙基-β-環(huán)糊精(HP-β-CD)包合苯并三氮唑,結(jié)合雙水相萃取技術(shù)萃取NO2--OPD-HP-β-CD衍生包合物。建立了 OPD衍生化-HP-β-CD包合-雙水相萃取-分子熒光光譜法檢測(cè)尿液中NO2-的分析新方法。在優(yōu)化的條件下,NO2-濃度在10-400 ng/mL范圍內(nèi)與熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,檢出限為0.5 ng/mL。方法的加標(biāo)回收率在89.1-93.7%之間,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于6.2%。研究了 NO2-與OPD衍生化反應(yīng)的機(jī)理,測(cè)定了 HP-β-CD分子包合NO2--OPD衍生物的包合比、包合常數(shù)。(4)采用正辛醇作為萃取劑,陽(yáng)離子表面活性劑十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)作為分散劑,對(duì)血漿和尿液中的NO2-衍生物進(jìn)行分離富集,結(jié)合酶標(biāo)儀分光光度法進(jìn)行測(cè)定。在最佳條件下,樣品中NO2-的濃度在10-800 ng/mL范圍內(nèi)與其吸光度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,檢出限為2.1 ng/mL,回收率高于90.1%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD低于4.7%。該方法利用表面活性劑既有疏水基團(tuán)又有親水基團(tuán)的特性,替代甲醇、乙腈、丙酮等有機(jī)分散劑,使萃取劑向液體樣本中快速分散,體系充分混合,增大了萃取劑與目標(biāo)分析物的接觸幾率,從而提高萃取效率。(5)本研究結(jié)合前四章的樣品前處理方法完成了新型NO3-和NO2-快速檢測(cè)試劑盒的初步構(gòu)建。試劑盒的成功研制不僅具有廉價(jià)優(yōu)勢(shì),還保證了檢測(cè)的重復(fù)性、精密度及靈敏度,具有一定的市場(chǎng)前景。在檢測(cè)方式上結(jié)合酶標(biāo)儀分光光度法,更能充分發(fā)揮其簡(jiǎn)單快速的優(yōu)勢(shì)。使用96孔酶標(biāo)板進(jìn)行測(cè)定滿足了臨床研究及科研檢測(cè)樣本量大的需求,旨在為臨床NO的研究提供快速、準(zhǔn)確的分析檢測(cè)手段。(6)以長(zhǎng)年生活在平原和急進(jìn)高原后的健康人群作為研究對(duì)象,采用第五章研究的NO3-和NO2-快速檢測(cè)試劑盒與酶標(biāo)儀分析法相結(jié)合,測(cè)定其血漿中NO3-和NO2-的含量,主要分析體內(nèi)NO3-/NO2-水平與海拔高度的相關(guān)性。應(yīng)用多重線性回歸、SPSS等相關(guān)統(tǒng)計(jì)方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。結(jié)果表明,平原人急進(jìn)高原后,血漿中NO2-水平略低于平原水平,與海拔的相關(guān)性更強(qiáng)。并隨海拔高度的升高而降低,實(shí)驗(yàn)結(jié)果大致與以往研究結(jié)果相近。因此檢測(cè)血漿中NO3-/NO2-的含量,對(duì)于高原反應(yīng)發(fā)病機(jī)理研究和急進(jìn)高原反應(yīng)前的防治具有一定的指導(dǎo)作用。
【學(xué)位授予單位】：昆明理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R339.5

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本文編號(hào)：1268762