本文關鍵詞：異養(yǎng)細菌硫化物氧化途徑及產(chǎn)物分析

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【摘要】：硫化物與地球上生命的出現(xiàn)有著千絲萬縷的聯(lián)系,硫化物與酸性含鐵的水相互作用促進了膠體性鐵硫蛋白膜的出現(xiàn),被認為大大提高了第一個有機物合成事件的頻率。從許多古代化石中可以發(fā)現(xiàn),有許多化能自養(yǎng)的生物是以硫化合物為基礎能源生活的,直到現(xiàn)在,硫化物繼續(xù)影響著許多生物的生長,而且硫在微生物生物質中是第6大豐富的元素,因此硫和硫化物的代謝對于地球化學循環(huán)至關重要。環(huán)境中H2S主要是由硫酸鹽還原作用,火山作用等產(chǎn)生,在生物體內也產(chǎn)生,主要來源于氨基酸的代謝。由各種方式產(chǎn)生的H2S還可以釋放到環(huán)境中,而且海洋中也會產(chǎn)生許多含硫化合物,例如氣態(tài)的H2S和SO2等都會釋放到空氣中。多余的H2S會污染空氣,SO2會造成酸雨等眾多環(huán)境質量問題。一般H2S的去除是氧化到硫酸鹽,之后被植物利用,從而完成硫循環(huán)的關鍵步驟,而自然界中H2S的氧化主要是靠微生物的作用,尤其是一些硫氧化細菌和古生菌。H2S的毒性與其濃度密切相關,在高濃度時會對生物產(chǎn)生神經(jīng)性的毒性,而在低濃度時可以起到重要的生理功能,如在哺乳動物中,高濃度的H2S會導致中毒,但低濃度H2S則可以調節(jié)各種生理功能等,由此H2S被認為是繼NO和CO后的第三種氣體信號分子。維持H2S的濃度對于生物來說至關重要,生物中過多的H2S主要是通過酶的聯(lián)合作用發(fā)生氧化而去除的。在哺乳動物線粒體中包含了一套重要的酶系統(tǒng),該系統(tǒng)由硫醌氧化還原酶(SQR),過硫化物雙加氧酶(PDO)和硫轉移酶(ST)組成,這3個酶進行聯(lián)合作用,將H2S代謝為硫代硫酸鹽,該系統(tǒng)的代謝路線已經(jīng)被報道,但對于H2S的氧化途徑仍存在著一些不清楚的問題。這些問題主要集中在(1)硫醌氧化還原酶氧化H2S的產(chǎn)物一硫烷硫,具體是什么形式的?在真核生物線粒體中SQR的活性需要有硫烷的受體,是否在所有的生物中都需要?如果需要,受體是什么?現(xiàn)有的報道認為谷胱甘肽,半胱氨酸,亞硫酸鹽都可能作為受體,但真正的生理受體并不清楚；(2) SQR/PDO/ST這套系統(tǒng)在異養(yǎng)細菌中是否存在?如果存在,其作用是否和真核生物中相似?(3)在異養(yǎng)細菌中是否存在與真核生物不同的還原性無機硫化合物的代謝途徑?其生理意義是什么?(4)在微生物中的研究大多都集中在自養(yǎng)型細菌中,在異養(yǎng)細菌中的研究較少,但是由于異養(yǎng)細菌廣泛的分布、數(shù)量的優(yōu)勢以及生長繁殖的快速等優(yōu)勢,使得它代謝H2S的速率可能更快,這可能具有重要的生態(tài)學意義。為了解決以上提出的問題,本文重點放在異養(yǎng)細菌H：S的生物氧化上,以大腸桿菌作為載體研究了SQR/PDO/ST系統(tǒng)的酶學、氧化H2S的能力、途徑以及產(chǎn)物等,或直接在野生菌Cupriavidus pinatubonensis JMP134中研究代謝H2S的情況。具體研究了以下內容：(1) 利用已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的過硫化物雙加氧酶(PDO)基因作為查詢序列,通過BLAST程序,在已經(jīng)測序的細菌基因組中,尋找是否有存在于細菌中的過硫化物雙加氧酶。結果發(fā)現(xiàn)該酶的同源蛋白質廣泛存在于細菌中,并主要集中在變形菌門和藍細菌門,約占已經(jīng)測序細菌基因組總量的20%；根據(jù)多序列比對,將新發(fā)現(xiàn)的與已經(jīng)報道的蛋白質進行了系統(tǒng)發(fā)育樹的構建,以此將可能的過硫化物雙加氧酶分為3類：PDO1, PDO2和Blh,并且這3類與GloB1和GloB2的親緣關系較近,后兩者都是乙二醛酶。已經(jīng)報道的MxPDO1和PpPDO2的結構解析顯示PDO1和PD02在底物結合位點上的區(qū)別,從而說明了本文對于PDO的分類的準確性。從這3類PDO以及GloB1和GloB2中共挑取了14個蛋白質,利用GSSH作為底物對其酶活性進行了鑒定,發(fā)現(xiàn)有8個酶具有過硫化物雙加氧酶活性,分別屬于PDO1, PDO2和Blh這三類,其中以MxPDO1 a催化效率最高,在GloB1和GloB2中選擇的蛋白質均沒有活性,與我們用進化樹進行預測的結果相吻合。通過ICP-MS檢測了CpPDO2等酶的重金屬組成,發(fā)現(xiàn)它含有與蛋白濃度等量的Fe2+,并利用透析實驗和金屬離子孵育的方法進一步確認了PDO需要Fe2+作為輔因子,一部分PDO中可以用Mn2+取代Fe2+,這與過硫化物雙加氧酶屬于MBL (metallo-β-lactamase)家族的特征相符合。根據(jù)序列相似性,利用BLASTP程序尋找了在革蘭氏陽性細菌中的可能的硫加氧酶,將這3個可能的硫加氧酶基因與已知活性的CpSQR的基因連接在一起,并克隆至pBBR1MCS2質粒上,再轉化入E. coli BL21 (DE3),分析了該菌株的活性,發(fā)現(xiàn)異源表達的菌株能夠快速的代謝H2S,說明這些陽性菌中可能的硫雙加氧酶具有氧化硫烷(由CpSQR代謝H2S產(chǎn)生)的能力,但無法確定其是否以GSSH作為底物。將PaPDO2在其野生菌株Pseudomonas aeruginosa PAO1敲除后發(fā)現(xiàn)突變株APaPDO2積累了更多的H2S,這說明PDO在細菌H2S的氧化中起到重要的生理功能。(2) 將Cupriavidus pinatubonensis JMP134中的2個酶, CpSQR和CpPD02克隆至大腸桿菌中,進行異源表達,研究它們代謝H2S的途徑。由于CpSQR中包含2個結構域,HcaD和DUF442,其中根據(jù)已經(jīng)報道的文獻知道HcaD是一個硫醌氧化還原酶,而DUF442則是一個可能的硫轉移酶。結果發(fā)現(xiàn)CpSQR代謝H2S的產(chǎn)物主要是二硫化物和三硫化物,這與真核生物中不同；另外,發(fā)現(xiàn)并證明了CpDUF442是一個具有硫轉移酶功能的結構域,它在3個酶催化H2S的反應中起到的作用都與在真核生物中的硫轉移酶不同,其中一個新功能是它促進SQR產(chǎn)物多硫化物和GSH的反應速度,這暗示著CpDUF442在促進硫烷轉移速率上發(fā)揮了重要的作用；另外,CpDUF442還催化GSSH和SO32-的反應,這與真核生物中報道的一致。發(fā)現(xiàn)了多硫化物和GSH或亞硫酸鹽可以自發(fā)反應,并通過光譜學方法計算了它們的自發(fā)反應速率,分別是8.4±0.7 μM min-1和6.3±0.5 pM min-1,當加入CpDUF442時,前者的反應速度增加為13.3±1.2)μM min-1,而后者則沒有明顯變化。生化實驗和體內分析數(shù)據(jù)都表明,CpDUF442不能以硫代硫酸鹽作為底物,這與人和酵母線粒體中硫轉移酶能轉移硫代硫酸鹽和GSH反應生成GSSH和亞硫酸鹽的結論不一致。本文還對異源表達菌株代謝H2S和多硫化物的途徑進行了闡述,研究了它們的代謝產(chǎn)物,并利用代謝產(chǎn)物進行了流量平衡分析：CpSQR和CpPDO2代謝H2S的產(chǎn)物為亞硫酸鹽和硫代硫酸鹽的混合物,有少量的硫烷累積,從流量平衡分析來看,CpDUF442催化GSSH和SO32-的功能在該系統(tǒng)中的作用并不明顯,硫轉移酶在代謝H2S過程中所起的作用可能主要是促進硫烷硫的分配,例如多硫化物和GSH的反應。最后,根據(jù)流量平衡分析提出了H2S在大腸桿菌中氧化途徑的模型。(3) 在Cupriavidus pinatubonensis JMP134中,利用已經(jīng)測序的基因組數(shù)據(jù),對其硫化合物代謝相關的基因進行了系統(tǒng)的分析,發(fā)現(xiàn)它具有多個和硫化合物氧化相關的系統(tǒng),分別是SQR/PDO/ST系統(tǒng),SOX系統(tǒng),SO系統(tǒng)以及FCSD系統(tǒng)等,利用無痕敲除對這些系統(tǒng)的關鍵基因進行了單敲除或多敲除,并利用野生菌和敲除菌株的全細胞分析了代謝H2S,SO32-或S2032-的產(chǎn)物。分析結果發(fā)現(xiàn),負責H2S氧化的主要是SQR/PDO/ST系統(tǒng),SOX系統(tǒng)可能在SQR功能失活后起到互補的功能,也可能是互補SQR的功能,但是效率不高；在野生菌中SQR/PDO/ST系統(tǒng)代謝H2S時可檢測到的產(chǎn)物只有S2O32-,這與利用大腸桿菌異源表達SQR/PDO/ST氧化H2S時的產(chǎn)物(S032-和S2032-的混合物)不同,分析與PDO的活性有關系,代謝產(chǎn)物是否具有SO32-仍需要進一步實驗；負責外源的SO32-氧化的主要是SO系統(tǒng),即SorAB,產(chǎn)物為硫酸鹽,并且亞硫酸鹽消耗和硫酸鹽生成接近1：1,SOX系統(tǒng)(包括SoxCD)并不能起到氧化外源亞硫酸鹽的作用；同樣,負責內源和外源S2032-氧化的系統(tǒng)主要是SOX系統(tǒng),氧化產(chǎn)物為硫酸鹽,每分子硫代硫酸鹽生成約2分子硫酸鹽,SoxF(即FCSD)可能作為SOX的一個重要部分參與其氧化硫代硫酸鹽和H2S,但是單獨作用并沒有氧化H2S的功能。亞硫酸鹽和硫代硫酸鹽的氧化途徑均符合質量守恒定律,這樣在細胞中不會過多地積累這一類硫化合物,均以硫酸鹽的形式排放到環(huán)境中。根據(jù)基因組分析和全細胞分析的結果,還提出了在異養(yǎng)細菌C. pinatubonensis JMP134中的硫化合物的代謝模型,該模型包括了從硫酸鹽的同化作用開始,到細胞內H2S的產(chǎn)生,以及H2S主要由SQR/PDO/ST系統(tǒng)氧化的過程,產(chǎn)物可能主要是SO32-,以及SO32-與SO32-在周質空間內依賴于SOX或SO系統(tǒng)的氧化情況等,還對于胞內的SO32-與SO32-之間的轉化及其與硫烷庫和硫轉移酶的關系進行了初步討論,該工作為將來可能應用帶有SQR和PDO酶的異養(yǎng)細菌去除環(huán)境中H2S的生物修復打下理論基礎。
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：Q93
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本文編號：1268517