本文關(guān)鍵詞：HeLa細(xì)胞周期中核仁超微結(jié)構(gòu)改組重構(gòu)行為與rDNA分布和轉(zhuǎn)錄的動(dòng)態(tài)變化研究

  更多相關(guān)文章： 核仁 細(xì)胞周期 胸腺嘧啶核苷 NAMA-Ur Bernhard PCNA B23

【摘要】：核仁是間期細(xì)胞核中最顯著的結(jié)構(gòu),是核糖體RNA基因轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)一步加工成熟的場(chǎng)所。核仁三個(gè)主要特征區(qū)域由纖維中心(fibrillar center,FC)結(jié)構(gòu)區(qū)域和致密纖維組分結(jié)構(gòu)區(qū)域(dense fibrillar component,DFC)以及顆粒區(qū)結(jié)構(gòu)區(qū)域(granular component,GC)組成。在細(xì)胞周期進(jìn)程中核仁發(fā)生規(guī)律的解體、消失和重建的過程,這種高度動(dòng)態(tài)變化的特點(diǎn)使核仁超微結(jié)構(gòu)及其功能的研究進(jìn)展緩慢,也是存在諸多爭(zhēng)論分歧的重要原因之一。爭(zhēng)論的主要焦點(diǎn)是核仁中核糖體基因(r DNA)分布以及轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄后形成r RNA前體的剪切位點(diǎn)等在哪個(gè)具體的區(qū)域?過去的大多數(shù)研究者只是針對(duì)細(xì)胞周期中某個(gè)時(shí)期的細(xì)胞核仁進(jìn)行相關(guān)的研究,卻忽視了核仁細(xì)胞分裂間期也是一個(gè)相對(duì)的動(dòng)態(tài)結(jié)果,核仁內(nèi)部結(jié)構(gòu)組分及其物質(zhì)是跟隨著G1期、S期、G2期進(jìn)程而發(fā)生變化,因此r DNA分布、轉(zhuǎn)錄和剪切位點(diǎn)也應(yīng)是動(dòng)態(tài)變化的。本文采用胸腺嘧啶核苷雙阻斷法對(duì)HeLa細(xì)胞進(jìn)行同步化培養(yǎng),PCNA免疫抗體標(biāo)記、吖啶橙特異性染色法以及常規(guī)電子顯微鏡超薄切片技術(shù)結(jié)合NAMA-Ur特異性方法、Bernhard染色法等對(duì)HeLa細(xì)胞核仁在細(xì)胞周期不同時(shí)段的超微結(jié)構(gòu)變化以及核仁中r DNA分布和轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)進(jìn)行研究,主要結(jié)果如下:1.HeLa細(xì)胞核仁FC和DFC在細(xì)胞周期進(jìn)程中不同時(shí)段的動(dòng)態(tài)變化:在早G1期的小核仁中FC和DFC的體積都較小,界限模糊,到晚G1期時(shí)段核仁體積變大,形成較大FC和DFC。早S期FC和DFC經(jīng)典構(gòu)型發(fā)生改變,中S期FC和DFC結(jié)構(gòu)消失,核仁內(nèi)呈現(xiàn)勻質(zhì)結(jié)構(gòu),晚S期時(shí),較小的FC結(jié)構(gòu)重新出現(xiàn),數(shù)量較多。G2期,大型FC和DFC與數(shù)量眾多的小FC和DFC并存于核仁中。2.通過NAMA-Ur方法對(duì)r DNA進(jìn)行特異性染色,結(jié)果顯示r DNA組分在細(xì)胞周期進(jìn)程中分布位置和形態(tài)隨著不同時(shí)期而改變:早G1期以染色質(zhì)纖維的形式分布在FC內(nèi)部或邊緣;晚G1期、早S期、晚S期和G2期的FC區(qū)域分布致密的染色質(zhì)塊和DFC區(qū)域周圍松散的DNA纖維組分;中S期DNA組分兩種形態(tài)分布:一種是FC區(qū)域染色較淺的團(tuán)塊狀DNA組分,一種是在勻質(zhì)結(jié)構(gòu)中的致密的顆粒狀DNA組分�？梢奃NA組分分布范圍隨著細(xì)胞周期進(jìn)程的不同時(shí)段而改變。3.通過Bernhard染色對(duì)核仁RNA進(jìn)行優(yōu)先染色,結(jié)果顯示HeLa細(xì)胞核仁r RNA轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)標(biāo)記出現(xiàn)在FC和DFC交界處以及DFC區(qū)域,在細(xì)胞間期不同時(shí)段的核仁中,結(jié)果也不盡相同:在G1期,核仁FC邊緣少量染色較淺的RNA組分。在早S期,FC區(qū)域邊緣有較少的RNA組分。在中S期,勻質(zhì)結(jié)構(gòu)內(nèi)的RNA組分呈致密的纖維條索狀相互連接。晚S期,FC邊緣含有致密的RNA顆粒組分。在G2期,主要在DFC區(qū)域及其與FC交界有致密的“半月形”RNA組分結(jié)構(gòu),說明此時(shí)轉(zhuǎn)錄生成r RNA初始產(chǎn)物的速度最高,活躍度最強(qiáng)。4.采用吖啶橙特異性染色HeLa細(xì)胞核仁DNA和RNA,結(jié)果顯示早G1期,較強(qiáng)的DNA綠色熒光分布核膜處,RNA橙色熒光主要分布在細(xì)胞質(zhì)。晚G1期和S期,DNA綠色熒光主要分布核仁及其核仁周邊,RNA橙色熒光主要分布在核仁。在G2期,RNA橙色熒光信號(hào)最強(qiáng),說明在G2期RNA轉(zhuǎn)錄活躍程度最強(qiáng)。5.采用B23蛋白免疫抗體標(biāo)記在光鏡下觀察細(xì)胞周期不同時(shí)段的熒光信號(hào)強(qiáng)度變化,觀察結(jié)果提示,在G1期、S期和G2期時(shí)段B23蛋白一直存在,特別是在G2期B23蛋白標(biāo)記熒光信號(hào)最強(qiáng),在分裂期細(xì)胞核仁內(nèi)幾乎觀察不到明顯的B23蛋白熒光信號(hào),說明在核仁中存在著活躍狀態(tài)和儲(chǔ)存狀態(tài)兩種不同形式。綜上所述,在HeLa細(xì)胞核仁結(jié)構(gòu)中FC和DFC數(shù)目和形態(tài)在細(xì)胞分裂間期過程中同樣是高度動(dòng)態(tài)變化的,特別是在中S期時(shí)段核仁FC和DFC發(fā)生了改組與重構(gòu)的形態(tài)學(xué)變化,這是我們的新發(fā)現(xiàn)。在細(xì)胞間期中核仁FC和DFC區(qū)域的r DNA組分也是動(dòng)態(tài)變化的。提示核仁r RNA轉(zhuǎn)錄、前體剪切的活動(dòng)狀態(tài)和位點(diǎn)隨著細(xì)胞間期的G1、S、G2期進(jìn)程而不斷變化。本實(shí)驗(yàn)觀察結(jié)果為進(jìn)一步闡明真核生物細(xì)胞核仁在細(xì)胞周期進(jìn)程中超微結(jié)構(gòu)與r RNA轉(zhuǎn)錄、剪切之間的關(guān)系提供和完善了更多的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：東北師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：Q243

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本文編號(hào)：1262444