本文關(guān)鍵詞：利用半理性和理性策略對酶活性及手性選擇性的設(shè)計(jì)

  更多相關(guān)文章： 手性化合物 理性設(shè)計(jì) 分子模擬 手性選擇性 酯酶BioH 酯酶RspE D-扁桃酸消旋酶

【摘要】：由于對映異構(gòu)體之間理化性質(zhì)和生理活性存在差異,手性化合物單體的光學(xué)純度是生物醫(yī)藥、精細(xì)化工和材料科學(xué)等諸多行業(yè)的重要標(biāo)準(zhǔn)之一。以酶介導(dǎo)的手性化合物的合成法,具有立體選擇性性高、反應(yīng)條件溫和等優(yōu)點(diǎn),是相關(guān)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。而酶的活性和手性選擇性作為這種方法的關(guān)鍵因素,決定了該方法的效率和產(chǎn)品的光學(xué)純度。因此,有必要對酶的活性和手性選擇性進(jìn)行優(yōu)化,以拓展其在手性化合物合成中的應(yīng)用。酶工程可以從分子水平上調(diào)控酶與底物的相互作用,是一種行之有效的優(yōu)化酶催化性質(zhì)的方法。本研究通過半理性和理性的酶工程策略,以在手性化合物合成中應(yīng)用廣泛的酯酶和脫氫酶為研究對象,對它們的活性和手性選擇性進(jìn)行設(shè)計(jì)優(yōu)化。首先,在前期對酯酶RspE在扁桃酸甲酯拆分中的手性選擇性的定向進(jìn)化中,發(fā)現(xiàn)手性選擇性最優(yōu)的第四輪突變體CVH (E 30.8,比活力24 μmolmi-1mg-1)的活性大大低于第二輪突變體YH (E 8.7,比活力142 μmolmin-1mg-1),出現(xiàn)了活性與手性選擇性負(fù)相關(guān)變化的現(xiàn)象。本研究針對這一現(xiàn)象,采用結(jié)構(gòu)分析與定點(diǎn)飽和突變相結(jié)合的半理性策略,經(jīng)過篩選得到了活性與手性選擇性同時保持高水平的突變體HMVY (E 36.8,比活力113 umolmin-1mg-1),其手性選擇性高于CVH并且活性與YH相當(dāng),實(shí)現(xiàn)了上述負(fù)相關(guān)現(xiàn)象的平衡。反應(yīng)動力學(xué)分析表明,這種活性和手性選擇性負(fù)相關(guān)現(xiàn)象的產(chǎn)生和被平衡是由于提高手性選擇性所采取的途徑不同造成的。突變體CVH通過大幅度抑制非偏好型底物的催化效率提高手性選擇性,因而降低了拆分反應(yīng)的活力；而突變體HMVY則通過特異性提高偏好型底物的催化效率,在提高手性選擇性的同時保持了拆分反應(yīng)的速率。分子模擬結(jié)果驗(yàn)證了反應(yīng)動力學(xué)分析的結(jié)果。同時,對突變點(diǎn)氨基酸的分析表明,HMVY中的組氨酸增強(qiáng)了對偏好型底物催化基團(tuán)的穩(wěn)定作用,同時纈氨酸和酪氨酸的協(xié)同配合改變了偏好型底物的結(jié)合位置和方式,優(yōu)化了其結(jié)合構(gòu)象。其后,利用理性設(shè)計(jì)策略,對酯酶BioH在潛手性3-苯基戊二酸二甲酯的不對稱水解中的手性選擇性進(jìn)行設(shè)計(jì)。蛋白-底物復(fù)合物的結(jié)構(gòu)分析表明,底物中的三位取代基在蛋白活性位點(diǎn)中的朝向是決定蛋白手性選擇性的關(guān)鍵因素。基于這一假設(shè),利用定點(diǎn)突變在蛋白活性口袋中引入與潛在S型底物的苯環(huán)產(chǎn)生特異性π-π堆疊作用的芳香族氨基酸,得到了手性選擇性顯著提高的突變體L86F,產(chǎn)物S-3-苯基戊二酸單酯的光學(xué)純度由25%(WT)提高到了93%(L86F)。為了進(jìn)一步證明以上理性設(shè)計(jì)策略的有效性和普適性,以酯酶RspE為研究對象,運(yùn)用同樣的思路,對其在潛手性3-苯基戊二酸二甲酯的不對稱水解中的手性選擇性進(jìn)行設(shè)計(jì)。通過引入芳香氨基酸殘基,使產(chǎn)物3-苯基戊二酸單酯的光學(xué)純度由野生型的13%(S)提高到突變體Y27R的99%(S),同時在不同位點(diǎn)引入該作用還得到了手性選擇性反轉(zhuǎn)的突變體M121F(50%,R)。這一結(jié)果不僅證明了該策略的有效性,可以分別得到S和R型的手性選擇性；同時還驗(yàn)證了上述理性設(shè)計(jì)策略的普適性,可以適用于活性口袋不用的蛋白。此外,本研究還通過理性設(shè)計(jì),對D-扁桃酸脫氫酶在R-鄰氯扁桃酸的氧化中的活性進(jìn)行優(yōu)化。將關(guān)鍵位點(diǎn)的丙氨酸替換為組氨酸,嘗試在蛋白和鹵代底物之間引入鹵鍵作用,以穩(wěn)定蛋白底物復(fù)合物。最終得到的突變體A89H對R-鄰氯扁桃酸的活性是野生型的5倍。本研究通過半理性和理性的酶工程策略,實(shí)現(xiàn)了對酯酶BioH、酯酶RspE和D-扁桃酸脫氫酶的活性與手性選擇性的設(shè)計(jì),有助于其在手性化合物的合成中的應(yīng)用。
【關(guān)鍵詞】：手性化合物 理性設(shè)計(jì) 分子模擬 手性選擇性 酯酶BioH 酯酶RspE D-扁桃酸消旋酶
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：O629.8
【目錄】：

• 致謝5-6
• 摘要6-8
• Abstract8-15
• 1 緒論15-38
• 1.1 手性化合物及其合成15-19
• 1.1.1 手性化合物15-16
• 1.1.2 手性化合物的應(yīng)用16-17
• 1.1.3 手性化合物的合成17-19
• 1.2 酶的手性選擇性及其改造19-28
• 1.2.1 酶的手性選擇性19-22
• 1.2.2 酶工程22-28
• 1.2.3 手性選擇性的改造28
• 1.3 分子模擬28-31
• 1.3.1 分子模擬簡介28-29
• 1.3.2 常用的分子模擬方法29-31
• 1.4 酯酶和脫氫酶及其在手性化合物合成中的應(yīng)用31-36
• 1.4.1 酯酶31-34
• 1.4.2 脫氫酶34-36
• 1.5 本文研究的主要內(nèi)容36-38
• 2 利用半理性設(shè)計(jì)平衡酯酶RspE定向進(jìn)化中的活性與手性選擇性的負(fù)相關(guān)變化38-53
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料38-40
• 2.1.1 菌株與質(zhì)粒38-39
• 2.1.2 工具酶39
• 2.1.3 試劑39
• 2.1.4 主要儀器39-40
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法40-45
• 2.2.1 分子對接及結(jié)構(gòu)分析40-41
• 2.2.2 突變體庫的構(gòu)建41-43
• 2.2.3 突變體庫的篩選43-44
• 2.2.4 優(yōu)勢突變體的活性測定44-45
• 2.2.5 代表突變體的動力學(xué)常數(shù)測定45
• 2.3 結(jié)果與討論45-52
• 2.3.1 結(jié)構(gòu)分析及突變點(diǎn)選定45-47
• 2.3.2 突變體庫的篩選47-49
• 2.3.3 代表突變體動力學(xué)常數(shù)的測定49-50
• 2.3.4 活性選擇性負(fù)相關(guān)現(xiàn)象產(chǎn)生與被平衡的酶反應(yīng)動力學(xué)原因50-51
• 2.3.5 活性選擇性負(fù)相關(guān)現(xiàn)象產(chǎn)生與被平衡的蛋白工程方法學(xué)原因51-52
• 2.4 小結(jié)52-53
• 3 酯酶RspE活性手性選擇性負(fù)相關(guān)變化現(xiàn)象的分子模擬53-67
• 3.1 實(shí)驗(yàn)方法53-56
• 3.1.1 蛋白分子結(jié)構(gòu)及突變體構(gòu)建53
• 3.1.2 底物分子結(jié)構(gòu)及力場參數(shù)確定53
• 3.1.3 蛋白-底物復(fù)合物的構(gòu)建53-54
• 3.1.4 分子動力學(xué)模擬54-55
• 3.1.5 模擬結(jié)果分析55-56
• 3.2 結(jié)果與討論56-66
• 3.2.1 模擬體系平衡情況分析56-57
• 3.2.2 反應(yīng)過渡態(tài)有效性分析57-60
• 3.2.3 功能基組原子的勢能分析60-61
• 3.2.4 口袋基組氨基酸與底物的相互作用能分析61-62
• 3.2.5 蛋白-小分子復(fù)合物的構(gòu)象分析62-63
• 3.2.6 突變熱點(diǎn)氨基酸對蛋白-底物相互作用的貢獻(xiàn)分析63-65
• 3.2.7 活性與手性選擇性負(fù)相關(guān)變化現(xiàn)象產(chǎn)生與被平衡的分子機(jī)理65-66
• 3.3 本章小結(jié)66-67
• 4 酯酶BioH在對稱二酯的不對稱水解中的手性選擇性的設(shè)計(jì)67-81
• 4.1 實(shí)驗(yàn)材料68
• 4.1.1 菌株與質(zhì)粒68
• 4.1.2 酶和試劑68
• 4.1.3 主要儀器68
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法68-73
• 4.2.1 3-苯基戊二酸二甲酯的合成68-69
• 4.2.2 BioH的克隆及突變體的構(gòu)建69-70
• 4.2.3 蛋白表達(dá)與純化70
• 4.2.4 蛋白純度表征及濃度測定70
• 4.2.5 3-苯基戊二酸二甲酯的不對稱水解70-71
• 4.2.6 酯酶BioH對3-苯基戊二酸二甲酯的不對稱水解及產(chǎn)物表征71
• 4.2.7 分子動力學(xué)模擬71-73
• 4.3 結(jié)果與討論73-80
• 4.3.1 酯酶BioH野生型對3-苯基戊二酸二甲酯的不對稱水解73-74
• 4.3.2 野生型BioH與底物的結(jié)合分析74-76
• 4.3.3 突變體設(shè)計(jì)76
• 4.3.4 酯酶BioH突變體對3-苯基戊二酸二甲酯的不對稱水解76-78
• 4.3.5 蛋白-底物復(fù)合物的分子模擬78-80
• 4.4 本章小結(jié)80-81
• 5 酯酶RspE在對稱二酯的不對稱水解中的手性選擇性的設(shè)計(jì)81-93
• 5.1 實(shí)驗(yàn)材料與方法81-82
• 5.2 結(jié)果與討論82-92
• 5.2.1 酯酶RspE野生型對3-苯基戊二酸二甲酯的不對稱水解82-83
• 5.2.2 酯酶RspE野生型與底物的結(jié)合分析83-85
• 5.2.3 突變體設(shè)計(jì)85
• 5.2.4 酯酶RspE突變體對3-苯基戊二酸二甲酯的不對稱水解85-87
• 5.2.5 蛋白-底物復(fù)合物的分子模擬87-89
• 5.2.6 酯酶在對稱二酯不對稱水解反應(yīng)中手性選擇性的來源89-90
• 5.2.7 手性選擇性設(shè)計(jì)策略討論90-92
• 5.3 本章小結(jié)92-93
• 6 D-扁桃酸脫氫酶DMdh對鄰氯扁桃酸的活性的設(shè)計(jì)93-109
• 6.1 實(shí)驗(yàn)材料94
• 6.1.1 菌株與質(zhì)粒94
• 6.1.2 酶和試劑94
• 6.1.3 主要儀器94
• 6.2 實(shí)驗(yàn)方法94-98
• 6.2.1 D-扁桃酸脫氫酶DMdh基因的亞克隆94
• 6.2.2 突變體A89H的構(gòu)建94-95
• 6.2.3 蛋白的表達(dá)純化95
• 6.2.4 蛋白純度表征及濃度測定95
• 6.2.5 扁桃酸及鄰氯扁桃酸的脫氫氧化95-96
• 6.2.6 分子動力學(xué)模擬96-98
• 6.3 結(jié)果與討論98-108
• 6.3.1 DMdh野生型對扁桃酸及鄰氯扁桃酸的脫氫氧化98-100
• 6.3.2 底物分子結(jié)構(gòu)分析100-102
• 6.3.3 DMdh野生型的結(jié)構(gòu)及分子動力學(xué)模擬102-105
• 6.3.4 突變體設(shè)計(jì)及活力測定105-106
• 6.3.5 突變體的分子動力學(xué)模擬106-108
• 6.4 本章小結(jié)108-109
• 7 結(jié)論與展望109-111
• 參考文獻(xiàn)111-122
• 附錄 用于基因合成的DMdh序列122-123
• 作者簡歷123-124

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