發(fā)布時(shí)間：2024-02-23 19:40

　　光學(xué)活性的手性砌塊是許多藥物的關(guān)鍵中間體,生物催化是制備高光學(xué)純度手性藥物砌塊的重要方法。但是,許多生物催化過程由于酶表達(dá)量低、穩(wěn)定性差、難以重復(fù)使用或反應(yīng)過程參數(shù)設(shè)置不合理等技術(shù)問題,導(dǎo)致生產(chǎn)效率低、成本高,難以實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。本論文選取三個(gè)手性藥物砌塊的酶促合成反應(yīng)作為典型案例,針對其關(guān)鍵技術(shù)瓶頸問題,分別采用基因異源表達(dá)、酶固定化及過程再優(yōu)化等不同策略,顯著提高了所用生物催化劑的比生產(chǎn)率,有力促進(jìn)了相關(guān)生物催化過程的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用,并為其他酶促反應(yīng)的合成應(yīng)用提供了成功案例。1.針對野生型微生物中酶表達(dá)水平不高導(dǎo)致粗酶制劑比生產(chǎn)率低下的問題,本文以西司他汀前體(S)-2,2-二甲基環(huán)丙烷甲酸酯的酶促合成為案例,通過對實(shí)驗(yàn)室前期分離的野生型紅球菌ECU1013的酯酶基因進(jìn)行克隆和異源表達(dá),強(qiáng)化了酶的表達(dá)水平,極大地提高了酶制劑的催化效率。重組酶制劑的比生產(chǎn)率提高了13倍,酶促反應(yīng)底物上載量由62.5 mM提高到500 mM,反應(yīng)時(shí)間由120 h縮短為16 h。在十克級規(guī)模制備實(shí)驗(yàn)中,產(chǎn)品分離收率30.2%(最大理論轉(zhuǎn)化率為50%),光學(xué)純度為97.4%ee。2.針對游離酶穩(wěn)定性差、難以重...

【文章頁數(shù)】：112 頁

【部分圖文】：

圖２．１基因文庫的Ｈ了酸甘油酷平板初篩??Ｆｉｇｕｒｅ?２．１?Ｉｎｉｔｉａｌ?ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ?ｏｆ?ｇｅｎｅ?ｌｉｂｒａｒｙ?ｂｙ?ｇｌｙｃｅｒｙｌ?ｔｒｉｂｕｔｙｒａｔｅ．??

圖２．１基因文庫的Ｈ了酸甘油酷平板初篩??ｒｅ?２．１?Ｉｎｉｔｉａｌ?ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ?ｏｆ?ｇｅｎｅ?ｌｉｂｒａｒｙ?ｂｙ?ｇｌｙｃｅｒｙｌ?ｔｒｉｂｕ圈的菌落進(jìn)行培養(yǎng)，菌體離也，用ＫＰＢＯＯＯｍＭＤｍｍ，°，

圖２．２重沮蛋白ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電泳圖??

?０．１７?３．０??純化的酶通過ＳＤＳ－ＰＡＧＥ進(jìn)行分析，達(dá)到單一條帶的純度，見圖２．３，其分子量大約??為３５．０ｋＤａ。進(jìn)而采用ＴＳＫＧ２０００ＳＷＸ１蛋白質(zhì)層析柱對酶進(jìn)行分子量分析，洗脫的蛋白??同樣呈現(xiàn)單一條帶，其表觀分子量為６９．８?ｋＤａ。結(jié)果表明ｉ？ＡＥｓｔｌ是一....

圖２．４?ｐＨ對ＷｆＥｓｔｒ活性的影響??Ｆｉｇｕｒｅ?２．４?Ｅｆｆｅｃｔ?ｏｆ?ｐＨ?ｏｎ?ａｃｔｉｖｉｔｙ?ｏｆ?ｐｕｒｉｆｉｅｄ?／？ＡＥｓｔｌ．??

（Ａ：?ＰＥＴ２８ａ）?（Ｂ：?ｐＥＴ４３ａ）??圖２．２重沮蛋白ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電泳圖??Ｆｉｇｕｒｅ?３．２?Ｓｏｄｉｕｍ?ｄｏｄｅｃｙｌ?ｓｕｌｆａｔｅ?ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ?ｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ?ｏｆ?ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ?ｐｒｏｔｅｉｎ??２．....

圖２．５溫度對／？々Ｅｓｔｌ活性的影響??Ｆｉｇｕｒｅ?２．５?Ｅｆｆｅｃｔ?ｏｆ?化ｍｐｅｒａｔｕｒｅ?ｏｎ?ａｃｔｉｖｉｔｙ?ｏｆ?ｐｕｒｉｆｉｅｄ?Ｗ＆Ｅｓｔｌ．??

圖２．５溫度對／？々Ｅｓｔｌ活性的影響??Ｆｉｇｕｒｅ?２．５?Ｅｆｆｅｃｔ?ｏｆ?化ｍｐｅｒａｔｕｒｅ?ｏｎ?ａｃｔｉｖｉｔｙ?ｏｆ?ｐｕｒｉｆｉｅｄ?Ｗ＆Ｅｓｔｌ．??隨后分別在３０、４０和５０°Ｃ條件下考察了Ｗ；Ｅｓｔｌ的溫度穩(wěn)定性，其失活曲線見圖２．６，??在３０、４０和....

本文編號：3907870