隨著現(xiàn)在人們工作節(jié)奏加快,過度性疲勞的病癥嚴重困擾著大量年輕人;由于現(xiàn)在人們的不良飲食結(jié)構和生活習慣,心腦血管等血栓性疾病在老年人當中的發(fā)病率也與日俱增。但目前市面上還尚未有安全可靠的可食性產(chǎn)品來幫助人們改善這兩種多發(fā)病癥。因此,本文對抗凝血和抗疲勞活性肽的深入研究探討則顯得非常有實用意義。寬體金線蛭、東亞鉗蝎蛋白質(zhì)含量高,是一種理想的制備活性多肽的原料。本文以寬體金線蛭、東亞鉗蝎為原料,提取分離蛋白,通過酶法可控制備抗凝血、抗疲勞活性多肽,建立了最佳酶解工藝條件,并進行動物體內(nèi)功效論證,再進行后續(xù)的分離純化、多肽序列測定,分析探討了氨基酸組成變化與多肽活性之間的關系,最后模擬多肽在體內(nèi)胃腸道的消化吸收實驗。采用堿溶酸沉法對寬體金線蛭、東亞鉗蝎蛋白進行了較高得率的提取。HPLC分析表明,寬體金線蛭分離蛋白WPI的分子量分布主要集中在4230 Da到92362 Da,東亞鉗蝎分離蛋白HPI的分子量分布主要集中在27510 Da到52436 Da范圍。采用酶制劑Alcalase AF 2.4L,Trypsin,Papain,Pepsin,Protamex,Flavourzyme等,探討了W... 

【文章來源】：華南理工大學廣東省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

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【學位級別】：博士

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摘要
ABSTRACT
第一章 緒論
    1.1 寬體金線蛭、東亞鉗蝎抗凝血研究現(xiàn)狀
        1.1.1 寬體金線蛭
        1.1.2 東亞鉗蝎
    1.2 生物活性肽
        1.2.1 生物活性肽的研究進展
        1.2.2 生物活性肽的制備分離及鑒定
            1.2.2.1 活性肽制備方法
            1.2.2.2 國內(nèi)外酶法制備活性肽現(xiàn)狀
            1.2.2.3 生物活性肽的分離純化
            1.2.2.4 生物活性肽的鑒定研究
    1.3 凝血及抗凝機制
    1.4 抗凝血活性肽的研究現(xiàn)狀
    1.5 抗疲勞的研究
        1.5.1 抗疲勞的研究現(xiàn)狀
        1.5.2 疲勞的產(chǎn)生機理
        1.5.3 抗疲勞肽機理
        1.5.4 活性肽體外抗氧化與體內(nèi)抗疲勞之間的關聯(lián)
    1.6 本課題研究的立題依據(jù)和主要研究內(nèi)容
        1.6.1 本課題的立題依據(jù)
        1.6.2 主要研究內(nèi)容
第二章 寬體金線蛭、東亞鉗蝎分離蛋白的提取及理化性質(zhì)
    2.1 引言
    2.2 實驗材料與設備
        2.2.1 實驗材料
        2.2.2 主要儀器設備
        2.2.3 主要試劑
    2.3 實驗方法
        2.3.1 基本成分的測定
        2.3.2 寬體金線蛭分離蛋白(WPI)和東亞鉗蝎分離蛋白(HPI)的制備
        2.3.3 堿溶酸沉pH值確定
        2.3.4 分離蛋白提取率的計算
        2.3.5 分離蛋白的相對分子量分布
        2.3.6 分離蛋白的氨基酸組成分析
    2.4 結(jié)果與討論
        2.4.1 兩種原料的主要成分
        2.4.2 堿溶酸沉過程中pH值的確定
        2.4.3 兩種分離蛋白的相對分子量分布
        2.4.4 兩種分離蛋白的氨基酸組成分析
    2.5 本章小結(jié)
第三章 寬體金線蛭、東亞鉗蝎分離蛋白的酶解工藝研究
    3.1 引言
    3.2 實驗材料與設備
        3.2.1 實驗材料
        3.2.2 主要儀器設備
        3.2.3 主要試劑
    3.3 實驗方法
        3.3.1 酶解工藝過程
        3.3.2 Alcalase催化分離蛋白水解工藝優(yōu)化
        3.3.3 不同酶催化下分離蛋白轉(zhuǎn)化為可溶性肽得率
            3.3.3.1 標準曲線繪制
            3.3.3.2 可溶性肽含量測定
        3.3.4 酶解分離蛋白產(chǎn)物的相對分子量測定
        3.3.5 氨基酸組成測定
        3.3.6 酶標儀測定抗凝血活性
            3.3.6.1 試劑配制
            3.3.6.2 抗凝血活性的測定
    3.4 結(jié)果與討論
        3.4.1 蛋白酶種類對兩種分離蛋白WPI和HPI水解反應的影響
            3.4.1.1 加酶量對兩種分離蛋白水解反應的影響
            3.4.1.2 底物濃度對兩種分離蛋白水解反應的影響
            3.4.1.3 水解時間對兩種分離蛋白水解反應的影響
    3.5 六種酶水解底物蛋白轉(zhuǎn)化為可溶性肽的得率
    3.6 酶解產(chǎn)物WA和HA的相對分子量分布
    3.7 酶解產(chǎn)物的氨基酸組成
    3.8 本章小結(jié)
第四章 兩種產(chǎn)物多肽的體內(nèi)抗血栓活性評價
    4.1 引言
    4.2 實驗材料與設備
        4.2.1 實驗材料
        4.2.2 主要儀器設備
        4.2.3 主要試劑
    4.3 實驗方法
        4.3.1 小鼠分組飼養(yǎng)
        4.3.2 小鼠造模
        4.3.3 抗凝血四項基本指標 (APTT, PT, TT, FIB)
            4.3.3.1 APTT測定
            4.3.3.2 TT測定
            4.3.3.3 PT測定
            4.3.3.4 FIB測定
    4.4 結(jié)果與討論
        4.4.1 各組小鼠的黑尾出現(xiàn)率
        4.4.2 各組小鼠的黑尾比
        4.4.3 各劑量多肽對小鼠凝血功能的影響
    4.5 本章小結(jié)
第五章 兩種產(chǎn)物多肽的抗氧化及抗疲勞活性評價
    5.1 引言
    5.2 實驗材料與設備
        5.2.1 實驗材料
        5.2.2 主要儀器設備
        5.2.3 主要試劑
    5.3 實驗方法
        5.3.1 產(chǎn)物多肽的抗氧化活性測定
            5.3.1.1 清除二苯代苦味�；�(DPPH·)能力的測定
            5.3.1.2 清除羥基自由基(·OH)能力的測定
            5.3.1.3 還原能力的測定
            5.3.1.4 對AAPH誘導紅細胞氧化性溶血的抑制率測定
        5.3.2 小鼠體內(nèi)抗疲勞實驗
            5.3.2.1 小鼠分組飼養(yǎng)
            5.3.2.2 小鼠游泳訓練
            5.3.2.3 小鼠力竭游泳實驗
            5.3.2.4 小鼠體內(nèi)各生化指標的測定
            5.3.2.5 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學處理
    5.4 結(jié)果與討論
        5.4.1 活性肽體外抗氧化指標評價
            5.4.1.1 兩種酶解產(chǎn)物抑制自由基DPPH·的能力
            5.4.1.2 兩種酶解產(chǎn)物抑制自由基·OH的能力
            5.4.1.3 兩種酶解產(chǎn)物的還原能力
            5.4.1.4 兩種酶解產(chǎn)物抑制AAPH誘導紅細胞氧化性溶血的能力
        5.4.2 動物體內(nèi)抗疲勞實驗
            5.4.2.1 小鼠的體重變化
            5.4.2.2 灌胃物對小鼠力竭游泳時間的影響
            5.4.2.3 灌胃物對小鼠肝、肌糖原的影響
            5.4.2.4 灌胃物對小鼠體內(nèi)血清乳酸(LD)形成的影響
            5.4.2.5 灌胃物對小鼠體內(nèi)血清尿素氮(BUN)的影響
            5.4.2.6 灌胃物對小鼠體內(nèi)血清肌酸激酶(CK)含量的影響
            5.4.2.7 灌胃物對小鼠體內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)含量的影響
    5.5 本章小結(jié)
第六章 抗凝血多肽的分離純化及結(jié)構鑒定
    6.1 引言
    6.2 實驗材料與設備
        6.2.1 實驗材料
        6.2.2 主要儀器設備
        6.2.3 主要試劑
    6.3 實驗方法
        6.3.1 DEAE sepharose FF陰離子交換柱的分離純化
        6.3.2 水解物的疏水值計算
        6.3.3 凝膠Sephadex G-15 層析分離
        6.3.4 制備型RP-HPLC柱分離活性肽
        6.3.5 溶血栓活性實驗
        6.3.6 分離純化肽的氨基酸組成及疏水值測定
        6.3.7 多肽的MALDI-TOF-TOF MS序列測定
        6.3.8 模擬胃腸道消化實驗
    6.4 結(jié)果與討論
        6.4.1 酶解產(chǎn)物HA的分離純化
        6.4.2 酶解產(chǎn)物WA的分離純化
        6.4.3 組分WA_(3-1)的體外溶栓活性
        6.4.4 分離過程中各產(chǎn)物的氨基酸組成比較
        6.4.5 分離純化多肽組分WA_(3-1)和HA_(183B-8)的結(jié)構鑒定
        6.4.6 模擬胃腸道消化對WA_(3-1), HA_(183B-8)的生物活性的影響
    6.5 本章小結(jié)
第七章 合成活性肽的體外模擬小腸吸收研究
    7.1 引言
    7.2 實驗材料與設備
        7.2.1 實驗材料
        7.2.2 主要儀器設備
        7.2.3 主要試劑
    7.3 實驗方法
        7.3.1 合成肽的純化及鑒定
        7.3.2 Caco-2 細胞模型的建立
        7.3.3 合成肽在Caco-2 細胞模型中的吸收實驗
    7.4 結(jié)果與討論
        7.4.1 兩種合成肽的純化及鑒定
        7.4.2 合成肽在Caco-2 細胞模型中的轉(zhuǎn)運
    7.5 本章小結(jié)
結(jié)論與展望
    一 結(jié)論
    二 主要創(chuàng)新點
    三 展望
參考文獻
附錄
攻讀博士學位期間取得的研究成果
致謝
附件



本文編號：3584457