凝血酶適配體HD1可以控制凝血酶的活性,調控凝血過程,因有望成為生物無毒的抗栓核酸藥物而被廣泛關注。在凝血酶適配體HD1基礎上,產生的重復序列HD1凝血酶適配體和二價凝血酶適配體（HD1序列與HD22序列串聯）,有望進一步增強結合效率和拓展應用領域。從單分子水平上對這些凝血酶適配體的行為進行研究,有利于揭示它們的作用機制,為更好的設計核酸藥物或傳感器提供理論依據。基于磁鑷的單分子力譜技術在微小力控制方面具有超強的穩(wěn)定性,為在長時間尺度下操控和研究核酸與蛋白質的相互作用提供了有力的工具。本論文在第一章中,詳細地介紹了磁鑷單分子力譜技術,包括磁鑷的構造及原理、工作過程和數據的獲得與分析、單分子拉伸的獲得與判斷標準、磁鑷力值校正方法。在接下來的章節(jié)中以磁鑷單分子力譜為主要表征手段,以研究單個凝血酶適配體及其衍生物的高級結構、力學穩(wěn)定性、折疊動力學和各結構單元的協同工作機制等為目標,開展了以下四方面的工作。在本論文第二章中,利用共價偶聯和雙指數函數力值校正等方法,構建了基于磁鑷的單分子操縱及測量系統(tǒng),為本論文的研究工作奠定了基礎。本章以2700bp雙鏈DNA和八聚GB1蛋白為模型體系,對共價偶... 

【文章來源】：吉林大學吉林省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數】：143 頁

【學位級別】：博士

【部分圖文】：

AFM工作原理的示意圖(Bruker Nano Inc.,)。

力學探測系統(tǒng)是原子力顯微鏡力譜探測或者成像的重要核心系統(tǒng),由微懸臂(Micro Cantilever)與坐落于微懸臂的尖端的針尖(Tip)組成,如圖1.2所示,微懸臂是通常有長條狀的矩形和等腰三角形兩種形狀,當然也有特殊定制的L型等等形狀,其材質一般為氮化硅,二氧化硅或硅基等等。有些微懸臂的懸臂背部會被鍍上金屬材質的涂層,從而可以提高硅基材對光的反射效率,能夠提高激光反射的信號檢測靈敏度。由于原子力顯微鏡技術是通過針尖與基底上樣品的相互作用的反饋而產生形貌的,這種相互作用可以達到極小的力值,例如達到皮牛頓級別,甚至可以通過遠程的相互作用不接觸到樣品就能夠對樣品成像,其力學探測系統(tǒng)核心的靈敏檢測限受到周圍環(huán)境溫度濕度等等、系統(tǒng)穩(wěn)定性比如光電噪音等等的影響。為了能夠驅動探針的運動,后方的微懸臂必須具有足夠的動力能夠帶動針尖的運動。通過改變微懸臂的形狀和材料等等方法,微懸臂能夠提供合適的彈性系數,彈性系數小會使探針變軟故能夠提高力學探測系統(tǒng)的靈敏度,故檢測下限能夠向下拓展。原子力顯微鏡的光學檢測系統(tǒng)主要由四個器件構成:它們分別是:1.四象限光電檢測器(Position Sensitive);2.反射鏡(Mirror);3.棱鏡(Lens);4.激光二極管(Laser Diode)。激光二極管會發(fā)出一束非常集中的激光束,這束激光通過反射棱鏡的反射,能夠照射到微懸臂的尖端背部,隨后在微懸臂的尖端背部再被反射出去。通過將這速反射出來的激光打四象限光電檢測器上,就能夠通過反射的原理擴大微懸臂的偏轉,微懸臂的偏轉在光電檢測器能夠放大將近一千倍,如1997年Hansma等人在雜志《International Journal of Imaging Systems and Technology》發(fā)表的報道,他們使用原子力顯微鏡,測算到四象限光電檢測器上3-10 nm的位移只對應著微懸臂0.01 nm的偏轉[55]。這樣在使用原子力顯微鏡對非常微小的物體成像時,微小物體的形貌起伏會使得正在掃描的探針發(fā)生偏轉,從而使從微懸臂背面反射到四象限的激光束的位置發(fā)生變化,通過電腦將各種偏轉的方向和程度記錄下來,最終根據電腦的計算和成處微小物體的形貌。

從磁場上分類可以分為磁鑷(magnetic tweezers)、自由旋轉磁鑷(freely orbiting magnetic tweezers)、力矩磁鑷(magnetic torque tweezers)。傳統(tǒng)磁鑷應用兩塊條形永磁鐵產生磁場,如圖1.4A給出了傳統(tǒng)磁鑷的示意圖,并列的條形磁鐵所提供給磁球的外磁場是沿著水平方向的。內部連接了“磁球-DNA”的樣品池放置于高倍物鏡上,磁鐵放置在樣品池的另一側,對磁球施加磁力,進行單分子力學操縱。2011年,荷蘭代爾夫特理工大學的Nynke Dekker課題組開發(fā)了自由旋轉磁鑷,他們將條形磁鐵換為軸向充磁的環(huán)形磁鐵,如圖1.4B所示。這時候,施加在磁球上的磁場變成了沿豎直方向。磁感線由下而上,越往上越密集,磁場梯度依然存在,磁球仍然受到向上的力,然而由于磁場線沿豎直方向,磁球在水平方向不再受外來磁矩限制,可以自由轉動。因為小球下方生物大分子的連接位點幾乎不可能是在嚴格的正下方,在顯微鏡中可以看到小球以某一個點為圓心,在一個環(huán)狀區(qū)域內自由轉動。這個轉動對應的正是下方所連分子自身的轉到。自由旋轉磁鑷可以觀察分子的轉動卻不能添加外加轉矩。圖1.4C是力矩磁鑷。在自由旋轉磁鑷的環(huán)狀磁鐵外部加一個很小的磁鐵,這樣磁球會受到來自外界的一個很小的磁矩。轉動磁鐵,磁球隨之轉動但并不是完全同步。另外,從磁鐵性質上分類可以分為永磁鐵磁鑷和電磁鐵磁鑷。永磁鐵能夠在不施加外界干擾的條件下提供較強的磁力。而電磁鐵由于發(fā)熱等外因影響,有時會對體系產生一定影響。但電磁鐵的磁力和磁場控制更為精確便捷。

【參考文獻】：
期刊論文
[1]單分子水平高分子相互作用的AFM成像與單分子力譜研究[J]. 張文科.  高分子學報. 2011(09)
[2]凝血酶的結構及其變構特性[J]. 許善峰,李芳,姜涌明,楊生妹.  中國醫(yī)學生物技術應用. 2004(03)



本文編號：2935263