L-賴氨酸(L-lysine, HO2CCH(NH2)(CH2)4NH2)是一種α-氨基酸,作為人體必需的氨基酸之一,與L-精氨酸和L-組氨酸一樣,屬于堿性氨基酸,能促進(jìn)人體發(fā)育、增強(qiáng)免疫功能并提高中樞神經(jīng)組織的功能。在動(dòng)物飼料中添加L-賴氨酸可以明顯改善飼料中氨基酸的營(yíng)養(yǎng)吸收平衡,促進(jìn)家畜的健康快速成長(zhǎng)。然而由于L-賴氨酸在谷物食品中含量甚低,且在加工過(guò)程中易被破壞而導(dǎo)致缺乏,故被稱為第一限制性氨基酸。作為一種在食品,醫(yī)藥以及化妝品等行業(yè)被廣泛使用的添加劑,雖然L-賴氨酸年產(chǎn)量在以非�？斓乃俣仍鲩L(zhǎng),但是其需求量也在逐年快速增長(zhǎng),例如2011年,全球L-賴氨酸的產(chǎn)量達(dá)到1,650,000噸,而2012年僅用于食品添加劑中的L-賴氨酸產(chǎn)量就超過(guò)了1,570,000噸。L-賴氨酸的生產(chǎn)最早主要是依靠化學(xué)合成法和蛋白質(zhì)水解法,但是這些方法存在原料來(lái)源有限或者成本較高、生產(chǎn)周期較長(zhǎng)、工藝復(fù)雜以及環(huán)境污染大等缺點(diǎn),因而逐漸被現(xiàn)代L-賴氨酸產(chǎn)業(yè)所淘汰。而生產(chǎn)原材料來(lái)源廣泛且成本較低、周期較短、工藝易于擴(kuò)大、環(huán)境污染小的微生物直接發(fā)酵法生產(chǎn)L-賴氨酸日益得到更加廣泛的應(yīng)用。微生物直接發(fā)酵法的最常用原料為制糖工業(yè)的廢糖蜜、淀粉水解液等非常廉價(jià)的糖質(zhì)原料或者醋酸、乙醇等。微生物發(fā)酵法生產(chǎn)L-賴氨酸的主要微生物有谷氨酸棒狀桿菌、乳糖發(fā)酵短桿菌、黃色短桿菌以及大腸桿菌等。這些發(fā)酵菌株主要通過(guò)上世紀(jì)50年代后期廣泛采用的微生物誘變育種以及抗阻遏反饋抑制等技術(shù)篩選和選育的。上世紀(jì)70年代以來(lái),隨著育種技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展,一些具有多重遺傳性狀的突變菌株被選育出來(lái),使發(fā)酵工藝逐漸地成熟和完善,L-賴氨酸的產(chǎn)量也得到快速地增長(zhǎng)。然而隨著近幾十年來(lái)發(fā)酵工業(yè)的不斷進(jìn)步,通過(guò)傳統(tǒng)遺傳操作改造所獲得的突變菌株,由于遺傳背景不清晰,多年傳代培養(yǎng)及發(fā)酵過(guò)程中的非定向進(jìn)化等原因,造成發(fā)酵菌株優(yōu)秀遺傳性狀的傳遞難于控制,菌種的選育和保藏困難,L-賴氨酸產(chǎn)量產(chǎn)率難以保持穩(wěn)定。由于L-賴氨酸的合成需要多種前體物,生物合成途徑中的調(diào)控機(jī)制比較復(fù)雜,傳統(tǒng)的遺傳操作及育種技術(shù)很難進(jìn)一步提高L-賴氨酸的產(chǎn)量。而且經(jīng)過(guò)數(shù)十年的技術(shù)積累,目前成熟的L-賴氨酸發(fā)酵菌株及其合成代謝途徑中的關(guān)鍵酶和基因的序列等都已被歐美日韓等國(guó)家申請(qǐng)專利,進(jìn)一步限制了L-賴氨酸工業(yè)的發(fā)展。近些年隨著代謝工程、比較基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)以及合成生物學(xué)的發(fā)展,人們對(duì)微生物關(guān)鍵代謝物的合成途徑及其調(diào)控機(jī)制的研究得到進(jìn)一步地深入,通過(guò)相關(guān)內(nèi)源基因的過(guò)量表達(dá)以及外源基因的引入,競(jìng)爭(zhēng)分支代謝途徑的減弱或者消除,轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的引入以及高通量的定向進(jìn)化篩選等技術(shù)手段,各種合成特定目標(biāo)化合物的微生物工程菌株被廣泛地應(yīng)用于各種氨基酸、有機(jī)酸、生物燃料、萜類化合物以及聚羥基脂肪酸等現(xiàn)代微生物發(fā)酵工業(yè)中。目前,雖然谷氨酸棒狀桿菌在各類發(fā)酵中占據(jù)主要地位,但是由于大腸桿菌具有遺傳背景清晰,遺傳操作技術(shù)簡(jiǎn)便成熟,易于培養(yǎng),生長(zhǎng)周期短等優(yōu)點(diǎn)而越來(lái)越多地被代謝工程改造并被用于許多有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的化合物的發(fā)酵生產(chǎn)中。針對(duì)L-賴氨酸生物合成途徑中的諸多限制性因素,本論文首先利用了代謝工程中常用的基因敲除、過(guò)表達(dá)相關(guān)基因、定點(diǎn)突變關(guān)鍵基因以及引入外源基因等技術(shù),對(duì)野生型大腸桿菌K-12 MG1655進(jìn)行了代謝工程改造。通過(guò)敲除編碼L-賴氨酸脫羧酶的cadA和ldcC基因,解除了其對(duì)細(xì)胞內(nèi)過(guò)量積累的L-賴氨酸的降解；敲除了編碼磷酸葡萄糖異構(gòu)酶的pgi基因,從而增加了流向L-賴氨酸合成途徑中所需的NADPH:敲除了編碼葡萄糖依賴的磷酸葡萄糖轉(zhuǎn)移系統(tǒng)(PTS)中的ptsG基因,從而減少了細(xì)胞內(nèi)磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)的消耗,為L(zhǎng)-賴氨酸的生物合成提供更多的前體；敲除三羧酸循環(huán)途徑(TCA)中的編碼琥珀酰輔酶A合酶的sucC/D基因,從而將TCA循環(huán)與L-賴氨酸的生物合成途徑相偶聯(lián),為后者提供更多了琥珀酰輔酶A；為了進(jìn)一步提高L-賴氨酸的產(chǎn)量,在低拷貝表達(dá)質(zhì)粒pCL1920上表達(dá)了來(lái)自于野生型大腸桿菌K-12 MG1655通過(guò)定點(diǎn)突變解除了末端產(chǎn)物L(fēng)-賴氨酸反饋抑制的編碼天冬氨酸激酶的lysCfbr基因、編碼二氫吡啶甲酸合酶的dapAfbr基因,以及二氨基庚二酸脫羧酶的lysA基因和來(lái)源于谷氨酸棒狀桿菌ATCC13032的編碼二氨基庚二酸脫氫酶的ddh基因,構(gòu)建了質(zhì)粒pCLIV,并且轉(zhuǎn)入重組大腸桿菌中構(gòu)建了L-賴氨酸的基礎(chǔ)生產(chǎn)菌株WML001。搖瓶發(fā)酵顯示該菌株的L-賴氨酸產(chǎn)量可以達(dá)到3.89g/L,為進(jìn)一步的改造提供了基礎(chǔ)。作為一門新興的科學(xué),合成生物學(xué)通過(guò)分子生物學(xué)、基因組學(xué)、信息技術(shù)和工程學(xué)各學(xué)科的交叉融合而產(chǎn)生一系列新的工具和方法。通過(guò)自然與合成元件的不同組合,來(lái)設(shè)計(jì)、改良、研發(fā)甚至制造各種具有特殊功能的生物體。雖然合成生物學(xué)與轉(zhuǎn)基因技術(shù)存在著一定的交叉,但它是進(jìn)一步地發(fā)展和改善,能夠更加高效,便捷地完成傳統(tǒng)遺傳技術(shù)難以完成的任務(wù)。核糖開關(guān)做為一類位于mRNA5'端非翻譯區(qū)的順式作用元件,具有一個(gè)配體結(jié)合區(qū)域,通過(guò)專一地與細(xì)胞內(nèi)某些特定的化合物相結(jié)合而發(fā)生構(gòu)象的變化,進(jìn)而影響與之相鄰基因的表達(dá),是目前合成生物學(xué)中應(yīng)用非常廣泛的一類遺傳元件。L-賴氨酸核糖開關(guān)是位于大腸桿菌lysC基因5'端上游的一段非翻譯序列,當(dāng)體內(nèi)L-賴氨酸的濃度較高時(shí),抑制下游基因序列的表達(dá),是一種“抑制型”的核糖開關(guān)。將該序列與編碼四環(huán)素抗性基因以及Ni2+通道蛋白的雙重篩選標(biāo)記tetA基因一同克隆至高拷貝表達(dá)載體pUCl 9上,構(gòu)建L-賴氨酸核糖開關(guān)篩選元件。當(dāng)將該元件轉(zhuǎn)入重組大腸桿菌中,如果宿主菌L-賴氨酸的產(chǎn)量較高,則會(huì)通過(guò)核糖開關(guān)抑制下游tetA基因的表達(dá),減少細(xì)胞對(duì)Ni2+的攝入,從而可使宿主菌在一定濃度有毒鹽離子(Ni2+)的存在下,獲得較高的生長(zhǎng)速率,而L-賴氨酸產(chǎn)量較低的菌株,則由于tetA基因的表達(dá)受到的抑制作用較弱而攝入較多的Ni2+,從而生長(zhǎng)速率較慢。本論文通過(guò)上述代謝工程技術(shù),得到了L-賴氨酸的基礎(chǔ)生產(chǎn)菌株WML001,但是其中起關(guān)鍵作用的天冬氨酸激酶lysCfbr等基因卻受到了日本味之素等公司的專利保護(hù),這限制了該菌株在未來(lái)的工業(yè)化應(yīng)用,因此本論文根據(jù)以前的研究成果采用了未見諸專利的來(lái)源于枯草芽孢桿菌天冬氨酸激酶Ⅱ的N末端區(qū)域和來(lái)自于棲熱胞菌天冬氨酸激酶C末端區(qū)域的融合酶BT作為該酶的替代。但是將該酶直接應(yīng)用于L-賴氨酸搖瓶發(fā)酵的時(shí)候,卻發(fā)現(xiàn)在重組大腸桿菌的搖瓶發(fā)酵產(chǎn)物中幾乎檢測(cè)不到L-賴氨酸。為此,本論文對(duì)酶進(jìn)行了全序列的隨機(jī)突變,并且利用了L-賴氨酸核糖開關(guān)做為工具,最終篩選富集到了三個(gè)突變BT酶。與目前發(fā)酵工業(yè)上廣泛采用的來(lái)自于大腸桿菌的天冬氨酸激酶lysCfbr基因的相比,這三個(gè)突變酶的宿主菌在相同的篩選條件下均表現(xiàn)出了更優(yōu)異的生長(zhǎng)速率。經(jīng)過(guò)三輪的富集篩選過(guò)程后,這三個(gè)突變酶的宿主菌分別占到了各自培養(yǎng)物菌群比例的72.5%,62.5%以及71.4%,證明L-賴氨酸核糖開關(guān)確實(shí)可以富集高產(chǎn)L-賴氨酸的有益突變菌；通過(guò)將編碼這三個(gè)突變BT酶的基因(bt1,bt2和bt3),野生型bt,以及天冬氨酸激酶Ⅲ的基因lysCfbr序列克隆至表達(dá)載體pET28a中,在大腸桿菌BL21中進(jìn)行原核表達(dá),發(fā)現(xiàn)這幾種酶在全細(xì)胞SDS凝膠電泳檢測(cè)中,占可溶性蛋白表達(dá)總量的30%左右。在進(jìn)行酶活檢測(cè)時(shí),這三個(gè)突變酶的酶活分別提高了77%,149%和160%,達(dá)到甚至超過(guò)了商業(yè)生產(chǎn)上廣泛使用的lysCfbr基因所編碼的天冬氨酸激酶的酶活；而當(dāng)將這些基因克隆至低拷貝表達(dá)質(zhì)粒pCL1920中,并轉(zhuǎn)入已經(jīng)在基因組上對(duì)dapA(編碼二氫吡啶甲酸合酶)進(jìn)行了解除反饋抑制定點(diǎn)突變的重組大腸桿菌中進(jìn)行“互補(bǔ)”搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)檢測(cè)時(shí),表達(dá)這三個(gè)突變酶的重組大腸桿菌的L-賴氨酸產(chǎn)量達(dá)到甚至超過(guò)了商業(yè)生產(chǎn)上廣泛使用的lysCfbr基因所編碼的天冬氨酸激酶。這些結(jié)果證明了L-賴氨酸核糖開關(guān)可以做為一種簡(jiǎn)單高效的篩選工具,對(duì)L-賴氨酸生物合成途徑的關(guān)鍵酶進(jìn)行定向進(jìn)化后的篩選,而無(wú)需復(fù)雜繁瑣的檢測(cè)方法和昂貴的實(shí)驗(yàn)儀器。該方法同樣也可以對(duì)該途徑中的其他關(guān)鍵酶,例如二氫吡啶甲酸合酶,進(jìn)行定向進(jìn)化后的篩選。本論文首先通過(guò)構(gòu)建L-賴氨酸的基礎(chǔ)生產(chǎn)菌株WML001,對(duì)L-賴氨酸生物合成途徑中的限制性因素進(jìn)行了研究；以產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用為前提,首次將核糖開關(guān)這一合成生物學(xué)元件引入L-賴氨酸合成途徑中關(guān)鍵酶的定向進(jìn)化后篩選,取得了預(yù)期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。本論文的工作為L(zhǎng)-賴氨酸工業(yè)化生產(chǎn)的進(jìn)一步發(fā)展提供了重要的研究基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：Q93;TQ922
【部分圖文】：

山東大學(xué)博壬學(xué)位論文逡逑時(shí)至長(zhǎng)出清晰的單克隆菌落；逡逑取單克隆菌落劃線于新鮮的１００邋＾ｉｇ／ｍＬ的壯觀霉素的ＬＢ。直溫倒置培養(yǎng)１０到１２小時(shí)至長(zhǎng)出清晰的單克隆菌落；勒，進(jìn)行菌落ＰＣＲ檢測(cè)，對(duì)檢測(cè)大小正確的單克隆進(jìn)行測(cè)序）測(cè)序正確的質(zhì)粒ＰＣＬ１９２０－如沁護(hù)少加Ａ－如＾即命名為ｐ

線性檢測(cè)范圍約為０．５－５％，從而可Ｗ將發(fā)酵產(chǎn)物直接用于檢測(cè)，無(wú)需稀釋。逡逑�。担纾�、ｌＯｇ／Ｌ、１５ｇ／Ｌ、３０ｇ／Ｌ、４５￡／１＾的以賴氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，按上述方逡逑法于ＯＤ４７０邋ｎｍ處測(cè)定吸光度，并且繪制以賴氨酸檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖２－４逡逑所示，吸光度與以賴氨酸濃度在一定濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)線性關(guān)系，得到的公式為逡逑ｙ＝２１６．７７ｘ＋３．１６，民２達(dá)到０．９９９，可＾文用于一定條件下的發(fā)酵液中的以賴氨酸的逡逑檢測(cè)；但是該方法所檢測(cè)到的以賴氨酸產(chǎn)量偏高，原因可能是由于發(fā)酵樣品含逡逑有以賴氨酸的結(jié)構(gòu)類似物等，并且由于所需的心賴氨酸濃度較高，對(duì)基本菌株逡逑生產(chǎn)以賴氨酸的檢測(cè)誤差較大。逡逑５０邋－１逡逑ｙ邋＝邋２１６．７７ｘ邋＋邋３ＪＬ＾逡逑４０邋－邐＝逡逑恮邋３０邋－逡逑ｔ邋２。－逡逑３邋１。／逡逑０邋Ｈ邐１邐１邐！邐！邐１逡逑０邐０．０５邐０．１邐０．巧邐０．２邐０．２５逡逑ＯＤ４７０邋ｎｍ逡逑圖２－４心賴氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－４邋Ｓｌ；ａｎｄａｒｄ邋ｃｕｒｖｅ邋ｏｆ邋Ｌ－ｌｙｓｉｎｅ逡逑２．３N２柱前衍生法逡逑由于酸性印王酬法測(cè)定以賴氨酸的產(chǎn)量數(shù)值偏大，并且所需要的以賴氨酸逡逑濃度較高，因此柱前衍生法也逐漸成為測(cè)定氨基酸的一種方法，尤其適合所構(gòu)建逡逑的起始產(chǎn)量較低的以賴氨酸基本生產(chǎn)菌株的檢測(cè)。該方法測(cè)量的氨基酸最大濃逡逑度約為４邋ｇ／Ｌ，若待檢測(cè)樣品中的氨基酸濃度較高時(shí)，應(yīng)該適當(dāng)稀釋后使用。雖逡逑然該方法檢測(cè)的靈敏度較高

線性檢測(cè)范圍約為０．５－５％，從而可Ｗ將發(fā)酵產(chǎn)物直接用于檢測(cè)，無(wú)需稀釋。逡逑�。担纾�、ｌＯｇ／Ｌ、１５ｇ／Ｌ、３０ｇ／Ｌ、４５￡／１＾的以賴氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，按上述方逡逑法于ＯＤ４７０邋ｎｍ處測(cè)定吸光度，并且繪制以賴氨酸檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖２－４逡逑所示，吸光度與以賴氨酸濃度在一定濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)線性關(guān)系，得到的公式為逡逑ｙ＝２１６．７７ｘ＋３．１６，民２達(dá)到０．９９９，可＾文用于一定條件下的發(fā)酵液中的以賴氨酸的逡逑檢測(cè)；但是該方法所檢測(cè)到的以賴氨酸產(chǎn)量偏高，原因可能是由于發(fā)酵樣品含逡逑有以賴氨酸的結(jié)構(gòu)類似物等，并且由于所需的心賴氨酸濃度較高，對(duì)基本菌株逡逑生產(chǎn)以賴氨酸的檢測(cè)誤差較大。逡逑５０邋－１逡逑ｙ邋＝邋２１６．７７ｘ邋＋邋３ＪＬ＾逡逑４０邋－邐＝逡逑恮邋３０邋－逡逑ｔ邋２。－逡逑３邋１。／逡逑０邋Ｈ邐１邐１邐！邐！邐１逡逑０邐０．０５邐０．１邐０．巧邐０．２邐０．２５逡逑ＯＤ４７０邋ｎｍ逡逑圖２－４心賴氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－４邋Ｓｌ；ａｎｄａｒｄ邋ｃｕｒｖｅ邋ｏｆ邋Ｌ－ｌｙｓｉｎｅ逡逑２．３N２柱前衍生法逡逑由于酸性印王酬法測(cè)定以賴氨酸的產(chǎn)量數(shù)值偏大，并且所需要的以賴氨酸逡逑濃度較高，因此柱前衍生法也逐漸成為測(cè)定氨基酸的一種方法，尤其適合所構(gòu)建逡逑的起始產(chǎn)量較低的以賴氨酸基本生產(chǎn)菌株的檢測(cè)。該方法測(cè)量的氨基酸最大濃逡逑度約為４邋ｇ／Ｌ，若待檢測(cè)樣品中的氨基酸濃度較高時(shí)，應(yīng)該適當(dāng)稀釋后使用。雖逡逑然該方法檢測(cè)的靈敏度較高

【共引文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 于雪飛;尹良鴻;李燁;李顏顏;王小元;;細(xì)菌蘇氨酸脫水酶受L-異亮氨酸反饋抑制的關(guān)鍵在于其調(diào)控結(jié)構(gòu)域[J];工業(yè)微生物;2014年05期

2 趙雨佳;張根林;周曉宏;李春;;核糖核酸開關(guān)用于微生物細(xì)胞工廠的智能與精細(xì)調(diào)控[J];化工學(xué)報(bào);2015年10期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前4條

1 趙躍芳;乙酰羥酸合成酶亞基間相互作用的研究[D];南開大學(xué);2013年

2 張少然;魚腥藍(lán)細(xì)菌PCC 7120中嚴(yán)謹(jǐn)反應(yīng)相關(guān)基因rel_(ana)的鑒定及功能分析[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

3 徐建中;基于代謝工程選育谷氨酸棒桿菌L-賴氨酸高產(chǎn)菌[D];江南大學(xué);2014年

4 張傳志;谷氨酸棒桿菌L-苯丙氨酸合成途徑系統(tǒng)改造及發(fā)酵優(yōu)化[D];江南大學(xué);2014年

本文編號(hào)：2813201