【摘要】：抗凍蛋白(AFP)是一種對冰晶的生長和重結晶有抑制作用的特殊蛋白質,具有熱滯效應(THA)、抑制重結晶效應(RI)、修飾冰晶形態(tài)效應三個基本特征。由于其具有阻止冰晶生長、抑制冰晶重結晶而使生命有機體免受結冰破壞的特點,AFPs有望在冷凍食品的保鮮方面發(fā)揮重大作用,成為一種有前景的冷凍食品添加劑。本文從冷誘導的燕麥籽粒中分離純化得到一種新型的植物抗凍蛋白(AsAFP),經序列鑒定后對其性質進行預測與分析;利用同源建模對AsAFP進行三維結構的模建,對AsAFP和冰晶面復合物進行分子動力學模擬,通過分子模擬技術分析其抗凍機理,為抗凍蛋白的研究實驗提供了理論指導;并將AsAFPs應用于冷凍面團及濕面筋蛋白中,對凍藏過程中冷凍面團的理化特性和最終饅頭制品的質構,以及濕面筋蛋白的聚集行為、凍融特性、理化特性等進行了研究。論文首先從冷誘導的燕麥籽粒中經過一系列的分離純化步驟,得到電泳純的AsAFP,熱滯活性為1.24°C,通過MALDI-TOF-MS/MS法進行序列鑒定,并對其氨基酸組成、等電點及相對分子質量、二級結構及表面溶劑可及性等進行了預測和分析。結果表明:AsAFP的氨基酸序列為VSSVISSSLF EKMLLHRGFY TYDAFIAAAK SFPAFATTGS TDVRKREVAA FLAQTSHETT GGWPTAPDGP YELGSTSDYF GRGPIQISYN YNYGAAGKAI GVDLLRNPDL VTSDNTVEFK TALWFWMTPQ SPKPSSHDVI TGRWSPSSTD KAAGRVPGYG VLTNIIDGGV ECGKGQESHV ADRIGYYKDN LDCYNQKPFA,與Endochitinase具有最大匹配度;AsAFP具有高親水性氨基酸殘基比例;其理論等電點為6.08,相對分子質量為21728.18;二級結構中含有大量的無規(guī)則結構,富含α-螺旋結構,且具有較高的表面溶劑可及性。以AsAFP氨基酸序列為探針,對AsAFP進行同源建模,將模建的蛋白與不同冰晶面進行對接,計算結合能量,并對AsAFP和冰晶層復合物進行分子動力學模擬。4DWX被認為是AsAFP的同源建模最佳模板,序列一致性達63%,序列覆蓋度達100%;以4DWX的三維結構為模板,采用modeller 9.14單模板建模并進行結構優(yōu)化,構建出準確性較高的AsAFP模型;以分子對接方法預測AsAFP和冰晶層復合物的結合模型,對接結果的分析發(fā)現,AsAFP的遙爪結構(由Helix和loop組成)是其與冰晶結合的主要位點,氫鍵作用和疏水相互作用在AsAFP和冰晶層的穩(wěn)定結合中起到關鍵的作用,Asn、Arg和Ser等氨基酸殘基參與形成氫鍵;對AsAFP和冰晶層復合物進行分子動力學模擬,分子動力學數據表明,AsAFP和冰晶層在動力學模擬過程中表現出很好的穩(wěn)定性,隨著時間的推移,回轉半徑、氫鍵數量、二級結構和溶劑可及表面保持平衡,進一步說明了AsAFP-冰晶層復合物結合的緊密;由于AsAFP與Prism型晶面在動力學模擬過程中產生的氫鍵數量最大,結合穩(wěn)定性最優(yōu),使其表現出的抗凍性更高。將AsAFPs添加到冷凍面團中,研究了凍藏過程中AsAFPs對冷凍面團的影響。研究表明:凍藏過程引起了面團體系可凍結水含量的增加,而AsAFPs的親水性使其可以吸附在自由水附近,限制水分的自由移動,從而顯著減緩可凍結水含量增加的幅度,而可凍結水含量決定了面團在凍藏過程中冰晶形成的數量,因此AsAFPs可以有效抑制凍藏過程中面團體系冰晶的形成;AsAFPs的存在可以降低面團水分流動性,抑制凍藏過程中強結合水的流失;降低凍藏過程中冷凍面團G'和G'的下降趨勢,增強冷凍面團的產氣和持氣能力,提高酵母菌的存活率,保護面筋網絡結構;提高饅頭最終品質,使饅頭制品更柔軟,提高饅頭制品的黏聚性和回彈性。將AsAFPs添加到面筋蛋白中,研究了凍藏過程中AsAFPs對面筋蛋白的影響。對面筋蛋白、麥谷蛋白、麥醇溶蛋白聚集行為的研究表明:凍藏過程中,面筋蛋白和麥谷蛋白中的GMP隨著凍藏時間的延長發(fā)生了不同程度的解聚,麥醇溶蛋白分子量分布范圍發(fā)生改變。AsAFPs的加入可以通過抑制冰晶形成和重結晶,減少凍結及凍藏對面筋網絡的破壞,保護面筋蛋白在凍藏過程中免受冰晶形成所造成的機械破壞,從而減緩面筋蛋白和麥谷蛋白的解聚,減小麥醇溶蛋白在凍藏過程中造成的機械損傷;SDS-PAGE電泳研究發(fā)現,凍藏對還原后的面筋蛋白和麥谷蛋白亞基并無影響;但面筋蛋白、麥谷蛋白、麥醇溶蛋白的自由巰基含量均有所增加,可見凍藏過程中二硫鍵的斷裂是導致高聚物發(fā)生解聚的主要原因。AsAFPs的添加可以減少二硫鍵的斷裂,降低自由巰基含量的增加。對面筋蛋白凍融特性的研究表明:對新鮮面筋蛋白而言,AsAFPs的添加可以增大面筋蛋白的熔融溫度區(qū)間,降低面筋蛋白樣品的熔融焓和可凍結水含量,提高玻璃化轉變溫度;而對于冷凍面筋蛋白,AsAFPs的添加可以降低水分流動性、熔融焓和可凍結水含量;對面筋蛋白流變學性質、二級結構和微觀性質的研究表明:AsAFPs可以減緩凍藏過程中冷凍面筋蛋白G'和G'的下降趨勢,保護面筋蛋白的α-螺旋和β-折疊結構免受冰晶損傷,保護面筋網絡結構。
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【學位授予單位】：江南大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：TS210.1

【參考文獻】

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本文編號：2429687