【摘要】：丙烯酰胺(acrylamide,AA)是富含碳水化合物的食品在熱加工過程中產(chǎn)生的2A類致癌物,職業(yè)暴露研究及體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均表明AA具有神經(jīng)毒性,并存在潛在的遺傳毒性、肝臟毒性等。氧化應(yīng)激及下游相關(guān)通路的激活可能是AA引起體內(nèi)毒性的機(jī)制之一。本研究利用小鼠原代神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞模型,探討了AA造成氧化應(yīng)激并導(dǎo)致神經(jīng)毒性的分子機(jī)制。進(jìn)而應(yīng)用天然抗氧化劑--藍(lán)莓花色昔提取物在昆明小鼠模型上,對(duì)AA所引起的氧化應(yīng)激進(jìn)行干預(yù),并探討可能的干預(yù)機(jī)制。主要的結(jié)果及結(jié)論如下:(1)通過免疫磁珠分選法,建立了原代星型膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞純培養(yǎng)模型。選取新生48 h內(nèi)小鼠,斷頭取腦,除去腦膜及明顯血管,過篩后在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中進(jìn)行貼壁培養(yǎng),期間去除少突膠質(zhì)細(xì)胞,待9-14天后星型膠質(zhì)及小膠質(zhì)細(xì)胞完全成熟,利用特異性抗體CD11+結(jié)合磁珠分選的方法,分別獲得星型膠質(zhì)及小膠質(zhì)細(xì)胞純培養(yǎng)體系,并運(yùn)用免疫熒光雙染法鑒定其純度,取純度大于90%的細(xì)胞做為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的研究材料。(2)通過MTT染色、測(cè)定活性氧自由基(Reactive oxygen species,ROS)含量、還原型谷胱甘肽(Glutathione,GSH)含量及GSH與氧化性谷胱甘肽的比值的測(cè)定,分別在星型膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞中,對(duì)AA染毒劑量進(jìn)行了篩選。結(jié)果表明細(xì)胞毒性、自由基含量及GSH的損失都與AA染毒濃度呈正相關(guān)。并最終確定O.1mM和1.0mMAA做為后續(xù)探究氧化應(yīng)激相關(guān)通路的最適作用濃度。在兩種細(xì)胞模型上,AA引起的ROS產(chǎn)生了典型的過氧化產(chǎn)物4-羥基壬烯醛和8-羥基脫氧鳥苷,并且進(jìn)一步促進(jìn)了 Nrf2及NF-κB轉(zhuǎn)移因子的入核,激活了下游相關(guān)通路;其中,Nrf2入核時(shí)間早于NF-κB,其下游抗氧化相關(guān)基因血紅素單加氧酶(HemeOxygenase1,HO1)、NADPH脫氫酶(NAD(P)Hq uinone dehydrogenase 1,NQO1)、谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(GlutathioneS-transferase,GST)在mRNA和蛋白的表達(dá)水平均有顯著提高,以抵抗AA所產(chǎn)生的ROS。隨著AA染毒時(shí)間延長(zhǎng)或劑量升高,其抗氧化相關(guān)的代償鏈崩潰,NF-κB入核激活下游與炎癥相關(guān)通路,白細(xì)胞介素(Interleukin,IL)IL1-β、IL6、腫瘤壞死因子(Tumor necrosisfactor,TNF)TNF-α在細(xì)胞上清中被檢出,細(xì)胞活力下降,最終導(dǎo)致死亡。相比于星型膠質(zhì)細(xì)胞,AA毒性會(huì)在小膠質(zhì)細(xì)胞中引起更多ROS蓄積、加速GSH耗竭、加快氧化產(chǎn)物的生成,更快速激活氧化應(yīng)激相關(guān)的Nrf2、NF-κB通路及下游基因,導(dǎo)致細(xì)胞死亡率增加。(3)通過MTT染色、測(cè)定ROS含量、GSH含量及GSH與氧化性谷胱甘肽的比值在星型膠質(zhì)/小膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)模型上進(jìn)行了 AA染毒劑量的篩選,細(xì)胞毒性、自由基含量及GSH的損失都與AA濃度呈劑量效應(yīng)關(guān)系。在共培養(yǎng)模型上,高劑量1.0mMAA能夠顯著提高4-羥基壬烯醛和8-羥基脫氧鳥昔的生成量,并進(jìn)一步促進(jìn)Nrf2及NF-κB轉(zhuǎn)移因子入核,進(jìn)而導(dǎo)致下游相關(guān)酶HO1、NQO1、GST/IL1-β、IL6、TNF-α順次激活。類似于純培養(yǎng),Nrf2的入核時(shí)間早于NF-κB。不同于兩種純培養(yǎng)模型,共培養(yǎng)Nrf2及NF-κB的激活速率介于兩者之間,即快于星型膠質(zhì)細(xì)胞而慢于小膠質(zhì)細(xì)胞。(4)通過對(duì)差異表達(dá)蛋白的篩選及對(duì)比,利用IPA軟件對(duì)其所影響的經(jīng)典通路、上游調(diào)節(jié)元件、蛋白互作網(wǎng)絡(luò)、主要生物功能進(jìn)行分析,得出過多ROS的產(chǎn)生,從而導(dǎo)致的細(xì)胞氧化損傷是AA介導(dǎo)的神經(jīng)毒性發(fā)生的主要原因之一。并且Nrf2和NF-κB通路可能是受AA毒性影響的主要通路,MAPK等磷酸化通路的改變可能是Nrf2和NF-κB激活的原因。本章蛋白組學(xué)結(jié)果預(yù)測(cè)與前兩章的實(shí)際觀測(cè)結(jié)果吻合。(5)藍(lán)莓花色苷提取物(Blueberry anthocyanins extract,BAE)對(duì)AA體內(nèi)干預(yù)的結(jié)果表明,50-250 mg/kg b.w./day的BAE能夠抑制AA染毒小鼠肝臟線粒體中ROS的產(chǎn)生,恢復(fù)線粒體電子傳遞鏈復(fù)合物以及ATP水解酶酶活,改善線粒體內(nèi)膜磷脂氧化及阻止膜電位消失,減少細(xì)胞色素c外漏并防止線粒體發(fā)生腫脹。推測(cè)BAE抑制AA所產(chǎn)生的氧化應(yīng)激與其保護(hù)線粒體功能性密切相關(guān)。
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【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：TS201.6

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 敬海明;李國君;;毒理蛋白質(zhì)組學(xué)研究進(jìn)展[J];國外醫(yī)學(xué)(衛(wèi)生學(xué)分冊(cè));2009年06期

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本文編號(hào)：2420192