【摘要】：西藏蕪菁(Brassica rapa L.)是在高寒低氧的惡劣環(huán)境下孕育出來的藥、食、飼三用植物。傳統(tǒng)的藏醫(yī)學(xué)典著和現(xiàn)代的《四川省藏藥材標(biāo)準(zhǔn)》等對西藏蕪菁有著詳細(xì)的性狀描述和功效記載,表明其具有"清熱解毒"、"滋補(bǔ)增氧"、"治療身體虛弱"、"祛風(fēng)"等功效。同時,本課題組前期的研究及文獻(xiàn)報道均表明西藏蕪菁塊莖的醇提物、水提物和全粉等均具有良好的抗缺氧功效。然而,對于西藏蕪菁的抗缺氧有效成分及其作用機(jī)制方面的研究尚未見報道。因此,本文首先采用人體試食試驗(yàn)對西藏蕪菁微粉的抗缺氧功效進(jìn)行驗(yàn)證。接著,以dPC12細(xì)胞在缺氧條件下的低細(xì)胞活力為依據(jù),建立物理缺氧和化學(xué)缺氧模型,通過體外評價明確西藏蕪菁中具有缺氧神經(jīng)損傷防護(hù)功效的部位,并對該部位進(jìn)行有效成分的分離、制備、純化和結(jié)構(gòu)解析。最后,分別從細(xì)胞水平和整體動物水平對有效化合物的抗缺氧功效及其作用機(jī)制進(jìn)行研究。主要研究內(nèi)容及成果如下:1.采用為期7天的人體試食試驗(yàn),結(jié)合低氧耐受測試(hypoxia inhalation test,HIT)(模擬7500 m海拔高度,氧含量7.1%)、運(yùn)動心肺功能測試(Bruce方案)和血生化指標(biāo)檢測,考察了連續(xù)攝取西藏蕪菁微粉(7.5 g× 2次/天)對普通健康人群低氧耐受力的影響。結(jié)果顯示,西藏蕪菁微粉能有效提高機(jī)體在HIT中的SpO2,緩解缺氧的不良癥狀,對機(jī)體的抗氧化能力具有顯著改善作用(P0.05)。運(yùn)動心肺功能測試表明蕪菁微粉可以顯著延后受試者的無氧閾出現(xiàn)時間、提高男性受試者的最大氧脈搏和女性受試者的最大公斤體重?cái)z氧量(P0.05)。此外,蕪菁微粉還能顯著增加男性受試者血液中的平均血紅蛋白濃度(P0.05)。進(jìn)一步印證了西藏蕪菁提高健康人群低氧耐受的功效。2.采用類神經(jīng)dPC12細(xì)胞(differentiated PC12 cell)株,分別建立物理缺氧和化學(xué)缺氧兩種體外評價模型。物理缺氧的造模條件:培養(yǎng)箱氣體組成比例為:0.5%O2+5%CO2 + 94.5%N2,培養(yǎng)時間36h;化學(xué)缺氧的造模條件:CoCl2濃度為300μmol/L,培養(yǎng)時間36h。西藏蕪菁干粉用無水乙醇熱回流提取,然后采用有機(jī)溶劑進(jìn)行分級萃取、獲得不同極性的部位。體外活性評價表明,正丁醇-乙酸乙酯相(中等極性部位)對缺氧導(dǎo)致的dPC12細(xì)胞損傷具有較好的防護(hù)作用,認(rèn)定其為蕪菁抗缺氧的有效活性部位。3.采用硅膠柱層析、固相萃取、制備型液相色譜等技術(shù)手段對上述有效部位進(jìn)行分離、純化和制備,從中得到10個單體化合物;并采用LC/Q-TOF/MS、NMR和X-單晶衍射等手段鑒定出6個酚酸類化合物,分別為4-羥基-苯甲酸葡萄糖苷、反式-對香豆酸葡萄糖苷、順式-對香豆酸葡萄糖苷、反式-阿魏酸葡萄糖苷、阿魏酸和芥子酸。運(yùn)用dPC12細(xì)胞體外評價模型,篩選出其中抗缺氧活性優(yōu)良的化合物為:反式/順式-對香豆酸葡萄糖苷(cis/trams-p-coumaric acid-β-D-glucopyranoside),且以反式結(jié)構(gòu)為主要存在形式。4.研究反式-對香豆酸葡萄糖苷(CG)對物理缺氧(0.5%O2)條件下細(xì)胞損傷的防護(hù)作用及其機(jī)制。用濃度為5～50μmol/L的CG處理dPC12細(xì)胞能夠有效增加細(xì)胞活力、降低細(xì)胞中LDH的釋放、減少細(xì)胞凋亡,并呈現(xiàn)良好的劑量依賴關(guān)系。同時,50μmol/L的CG能顯著抑制缺氧導(dǎo)致的dPC12細(xì)胞線粒體膜電位的下降和細(xì)胞色素C的釋放,提升細(xì)胞中抗凋亡蛋白(Bcl-2/Bax和Bcl-XL)的表達(dá),降低促凋亡蛋白(Caspase-3和Caspase-9)的活力(P0.05)。此外,qRT-PCR分析結(jié)果表明,CG同時也影響了編碼上述蛋白的mRNA水平。5.根據(jù)《保健食品檢驗(yàn)與評價技術(shù)規(guī)范》中的抗缺氧評判標(biāo)準(zhǔn),采用ICR小鼠常壓耐缺氧試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證西藏蕪菁的有效部位。連續(xù)30天灌胃50 mg/kg.bw/d的西藏蕪菁正丁醇相,能夠顯著延長雄性小鼠的缺氧存活時間(P0.05),顯示出較好的抗缺氧功效。接著,采用急性缺氧動物模型,研究了正丁醇相及其特征性化合物(CG)的苷元----香豆酸(CA)的抗缺氧相關(guān)機(jī)制,試驗(yàn)周期為7天,灌胃給藥。急性缺氧條件為:15 min內(nèi)將低氧氧艙中氧含量從21%降至9.5%,保持6 h。結(jié)果顯示,急性缺氧模型顯著增加了小鼠肺的含水量(P0.01),而正丁醇相(50 mg/kg.bw/d)和不同劑量的 CA(25、100 mg/kg.bw/d)均能有效抑制肺含水量的升高(P0.05);生化分析表明,其機(jī)制可能與提高急性缺氧條件下肺組織中Na+,K+-ATP酶活力、增強(qiáng)抗氧化能力(SOD↑、CAT↑和MDA↓)、抑制炎癥因子(TNF-α、IL-1β和IL-6)的升高有關(guān)。此外,50 mg/1kg.bw/d的正丁醇相對急性缺氧導(dǎo)致的小鼠腦組織中ATP的下降有一定的阻滯作用,可能與提高大腦無氧酵解相關(guān)酶(PK、PFK和LDH)的活力有關(guān)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：TS218

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本文編號：2383333