本文選題：天然籠形蛋白　切入點：人造籠形蛋白　出處：《中國農(nóng)業(yè)大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：籠形蛋白(Protein cage)在自然界中廣泛存在且發(fā)揮重要作用,其蛋白質(zhì)外殼具有三個活性界面,分別為外表面、內(nèi)表面以及亞基之間界面,通過化學和基因修飾這些界面可以賦予籠形蛋白新的功能特性。由于多亞基籠形蛋白具有對稱性高、溶解度好、穩(wěn)定性強、單分散等性質(zhì),所以具有合成納米顆粒、包埋小分子、靶向傳送并釋放藥物等功能。但自然界中現(xiàn)存的籠形蛋白數(shù)目、大小和形狀有限,不能滿足所有特定的應(yīng)用要求。近年來,報道了幾種制備新籠形蛋白的方法:從頭設(shè)計新蛋白、增加二硫鍵、增加靜電作用力、化學交聯(lián)、金屬離子介導(dǎo)和基因融合結(jié)構(gòu)單元或片段等。但是這些方法都有兩個主要的劣勢:難度大和任務(wù)重,所以急需建立一種新方法來制備出不同屬性的籠形蛋白。我們建立了 一種合成籠形蛋白的新方法,該方法的關(guān)鍵點在于重新設(shè)計目標蛋白的亞基界面,由3步組成:1、通過分析晶體結(jié)構(gòu)找出目標蛋白的關(guān)鍵界面;2、找出該界面上的關(guān)鍵氨基酸;3、刪除或者增加若干個氨基酸來重新設(shè)計亞基界面,使目標蛋白轉(zhuǎn)化成新的籠形蛋白。鐵儲藏蛋白是廣泛存在于動物、植物以及微生物中的一種籠形蛋白,能保持鐵代謝的平衡,并且去除二價鐵的毒性,由24個亞基組成,外徑為12納米,內(nèi)徑為8納米,整個分子呈432軸對稱。通過調(diào)節(jié)鐵儲藏蛋白亞基間的作用力可改變其組裝方式,使24聚鐵儲藏蛋白分別轉(zhuǎn)變?yōu)?8聚和16聚新型籠形蛋白。實驗結(jié)果如下:1、在鐵儲藏蛋白的4個亞基間界面中(C2、C3、C4和C3-C4),C3-C4界面所占比例最大,對鐵儲藏蛋白亞基組裝最為重要。但是該界面中D螺旋上的部分氨基酸殘基(139NEQVKA144)并不參與界面作用力,如果刪除這些氨基酸殘基可改變C3-C4界面的作用力,通過調(diào)節(jié)刪除氨基酸的數(shù)目(Δ139NE、Δ139NEQV、A139NEQVKA和Δ139NEQVKAIK),可使界面作用力逐步改變。對這些突變體進行構(gòu)建、轉(zhuǎn)化、表達、純化、表征和結(jié)晶后,發(fā)現(xiàn):刪除6個氨基酸后,突變體Δ139NEQVKA亞基自組裝成外徑為17納米的新型48聚籠形蛋白,它包含兩種亞基,這兩種亞基的氨基酸序列完全一樣,卻有不同的三級結(jié)構(gòu),以1:1的比例組裝成完整籠形蛋白。晶體溶解后,在溶液中存在48聚大分子,10個小時后,完全轉(zhuǎn)變?yōu)橛?個亞基組成的多聚體,前者在晶體中可穩(wěn)定存在,后者在溶液中更穩(wěn)定。本方法不僅改變了鐵儲藏蛋白的大小,而且有望改造自然界中其它籠形蛋白(如Dps、熱休克蛋白、E2蛋白等)。2、通過分析鐵儲藏蛋白界面作用力發(fā)現(xiàn):D螺旋對鐵儲藏蛋白的形成起著至關(guān)重要的作用,并且參與亞基兩端兩個疏水性核的形成。對突變體(%，

本文編號：1580232