本文關(guān)鍵詞：乳及乳制品中主要食源性致病菌的免疫快速檢測(cè)方法研究

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【摘要】：鮮乳及其生產(chǎn)過程中食源性致病菌的污染是乳制品安全的主要威脅之一。傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法雖然準(zhǔn)確,但耗時(shí)較長(zhǎng)、步驟繁多、檢測(cè)效率低,食品企業(yè)和基層檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)亟需一種準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、快速、成本低的分析手段來監(jiān)測(cè)原料、生產(chǎn)過程及最終產(chǎn)品中的致病微生物。本文調(diào)查了乳及乳制品中主要的食源性致病菌,以大腸桿菌O157:H7、金黃色葡萄球菌5種主要腸毒素、沙門氏菌、單增李斯特菌作為研究對(duì)象,并根據(jù)不同細(xì)菌的特點(diǎn)篩選、制備免疫原,來篩選特異性好、交叉均一的單克隆抗體,并基于配對(duì)抗體建立了準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、快速、低成本的免疫分析方法,應(yīng)用于乳品中的快速檢測(cè)。首先,為建立大腸桿菌O157:H7特異型的免疫分析方法,采用煮沸滅活的大腸桿菌O157:H7為免疫原免疫小鼠,經(jīng)過細(xì)胞融合、篩選,制備了特異性識(shí)別大腸桿菌O157:H7的單克隆抗體,通過兩兩配對(duì)獲得了配對(duì)抗體并建立了大腸桿菌O157:H7特異型的ELISA和膠體金試紙條方法,檢測(cè)限(P/N≥2.1)分別為1.1×105 CFU/m L和3×105 CFU/m L,與其它常見細(xì)菌無交叉反應(yīng)。同時(shí),用western blot研究發(fā)現(xiàn)配對(duì)抗體識(shí)別的抗原位點(diǎn)均為分子量為37 k Da的大腸桿菌O157:H7膜蛋白。第二,為建立金黃色葡萄球菌5種主要腸毒素(SEA,SEB,SEC,SED,SEE)的免疫分析方法,分別采用5種重組表達(dá)的腸毒素為免疫原制備了單克隆抗體,并通過配對(duì)和篩選獲得了5種腸毒素的最優(yōu)配對(duì)抗體,分別建立了相應(yīng)的ELISA和膠體金試紙條方法。5種腸毒素ELISA方法的實(shí)際檢測(cè)限分別為0.15、0.08、0.14、0.12、0.25μg/kg。并進(jìn)一步開發(fā)了可以同時(shí)檢測(cè)5種腸毒素的多重膠體金試紙條方法,應(yīng)用于乳品中金葡腸毒素的檢測(cè)。第三,為建立沙門氏菌屬的免疫分析方法,首先制備了鼠傷寒沙門氏菌鞭毛蛋白和脂多糖LPS的單克隆抗體,發(fā)現(xiàn)脂多糖單抗配對(duì)檢測(cè)鼠傷寒沙門氏菌的靈敏度較好,建立的ELISA和膠體金試紙條方法的檢測(cè)限分別為104 CFU/m L和1.3×105 CFU/m L,與O抗原相同的乙型副傷寒沙門有交叉反應(yīng),與其它沙門氏菌無交叉反應(yīng)。同時(shí)采用NaIO4和EDC法合成了沙門氏菌脂多糖的完全抗原用于免疫小鼠,制備了沙門氏菌屬特異性的LPS單抗,基于配對(duì)抗體建立了沙門氏菌屬ELISA方法,對(duì)12株不同O抗原的沙門氏菌的檢測(cè)限為1.3×105-1.2×106 CFU/m L。基于屬特異性LPS單抗5H12和Na IO4合成的LPS包被原,開發(fā)了一種基于競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)的沙門氏菌屬膠體金試紙條方法,可以成功檢測(cè)到測(cè)試的12株沙門氏菌,最低檢測(cè)限在106 CFU/m L,與其它常見細(xì)菌無交叉反應(yīng)。第四,為建立單增李斯特菌特異性的免疫分析方法,首先,采用P60蛋白為免疫原制備了單克隆抗體,發(fā)現(xiàn)這些單抗均一識(shí)別李斯特菌屬�；谂鋵�(duì)抗體,建立了李斯特菌屬的ELISA方法和膠體金試紙條方法,對(duì)測(cè)試的8株單增李斯特菌和4株李斯特菌均可檢測(cè),檢測(cè)限為105-106 CFU/m L,與其它測(cè)試細(xì)菌無交叉反應(yīng)。同時(shí),合成了Pep D多肽并用SMCC法與載體蛋白BSA偶聯(lián)作為免疫原,制備了單增李斯特菌特異性的單克隆抗體,發(fā)現(xiàn)PepD多肽單抗可與李斯特菌屬單抗配對(duì)并建立單增李斯特菌P60特異性的雙抗體夾心ELISA方法和膠體金試紙條方法,并成功將8株單增李斯特菌與4株李斯特菌區(qū)分出來,并與其它測(cè)試細(xì)菌無交叉反應(yīng)。第五,為了對(duì)傳統(tǒng)的金黃色葡萄球菌腸毒素B雙抗體夾心ELISA方法進(jìn)行增敏,在修飾4-NTP的金納米粒子表面還原特定厚度的Ag層,合成了具有強(qiáng)拉曼活性的、內(nèi)部包裹有4-NTP的金銀核殼結(jié)構(gòu)的納米顆粒,表面修飾金葡腸毒素B抗體后,在微孔板上實(shí)現(xiàn)了腸毒素B拉曼檢測(cè),該方法的最低檢測(cè)限為1.3 ng/kg,相比傳統(tǒng)的雙抗體夾心ELISA方法降低了25倍,可以用于牛奶中低含量金黃色葡萄球菌腸毒素B的檢測(cè)。
【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：TS252.7

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

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本文編號(hào)：1297129