本文關鍵詞：復雜環(huán)境下蛋白質結構、功能與穩(wěn)定性的NMR研究

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【摘要】：細胞環(huán)境極其復雜,大分子擁擠、空間上的限域以及弱相互作用普遍存在。蛋白質發(fā)揮功能的天然細胞環(huán)境很可能會影響到蛋白質的結構、功能以及穩(wěn)定性。核磁共振能夠在原子分辨率上提供蛋白質結構、功能以及穩(wěn)定性信息。NMR能夠在溶液狀態(tài)下研究擁擠、限域等環(huán)境效應對蛋白質結構的影響。我們運用NMR研究反膠束模擬的限域環(huán)境對多結構域蛋白結構與功能的影響;并利用19F NMR方法研究擁擠以及限域環(huán)境對KH1蛋白穩(wěn)定性的影響。反膠束限域環(huán)境影響了多結構域蛋白的結構。蛋白質限域不僅是細胞內包括伴侶蛋白腔內蛋白質的折疊與錯誤折疊、核糖體內蛋白質的生物合成、易位子內蛋白質的運輸?shù)壬镞^程的關鍵因素;同樣在藥物運輸、酶萃取與恢復以及治療藥物的保護等工業(yè)應用中也扮演著重要的角色。限域環(huán)境對多結構域蛋白結構的影響目前尚不清楚。我們利用NMR方法研究了反膠束限域環(huán)境對多結構域蛋白鈣調蛋白以及其復合物結構的影響。結果表明限域不會影響多結構域蛋白復合物holoCaM-MLCK的結構;該復合物在稀溶液中形成緊湊剛性結構。多結構域蛋白holoCaM在稀溶液中形成伸展的結構,限域會促使holoCaM形成緊湊的結構,結構域之間存在著接觸。除了結構域第四個螺旋的取向有一些差異外,N端與C端結構域的整體結構與稀溶液中伸展構象的結構域結構類似。反膠束限域環(huán)境改變了 holoCaM功能。我們通過holoCaM的1H-15N HSQC滴定實驗研究限域所引起的結構上變化對功能的影響。結果表明限域環(huán)境改變了 holoCaM的功能:holoCaM在稀溶液中可以和MLCK、AcN19以及somatostatin結合;在反膠束中只能與MLCK和AcN19結合。雖然親和力顯著不同,但holoCaM在稀溶液中和MLCK以及AcN19結合后各自形成緊湊的結構。CaM-somatostatin復合物的PCS和RDC數(shù)據(jù)表明該復合物結主要以伸展的構象存在。結構上的差異暗示holoCaM在反膠束中結合MLCK和AcN19,而不結合somatostatin很有可能是體積選擇的結果而不是由結合力強弱來決定。與holoCaM的緊湊結構相比,CaM-somatostatin復合物的伸展構象占據(jù)更大的空間。由于反膠束內的有限空間,holoCaM傾向于自己形成緊湊結構,而不是和somatostatin相互作用。復雜環(huán)境下KH1蛋白折疊以及結合的熱力學。細胞內蛋白質的折疊與結合通常發(fā)生在擁擠以及限域的環(huán)境內。已有的研究表明擁擠和限域環(huán)境會改變蛋白質的穩(wěn)定性,但是對同一個蛋白在不同復雜環(huán)境下的穩(wěn)定性的全面性分析研究很少。我們運用19F NMR研究了擁擠環(huán)境和限域環(huán)境對蛋白質穩(wěn)定性的影響。結果表明KH1在擁擠試劑中穩(wěn)定性增加,熵值減小而焓值減小。擁擠試劑的單體(sucrose、EG、glucose)比其多聚物(ficoll 70、PEG 200、dextran 70)更能穩(wěn)定蛋白質,蛋白質在擁擠試劑單體中比在多聚體中熵值更大而焓值更小,這與大分子擁擠的理論相違背。KH1在反膠束中穩(wěn)定性降低,是焓值增加而熵值也增加的。我們的結果與硬核排阻體積理論預測的結果完全相違背。蛋白質和反膠束內表面的化學相互作用可能起作用,這種化學相互作用的幾何性很有可能發(fā)揮作用。綜上所述,我們利用NMR研究了復雜環(huán)境對蛋白質結構、功能以及穩(wěn)定性的影響。我們認為細胞很有可能利用環(huán)境效應來調控蛋白質結構、功能與穩(wěn)定性。
【學位授予單位】：中國科學院大學(中國科學院武漢物理與數(shù)學研究所)
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：O629.7

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