發(fā)布時(shí)間：2017-12-10 16:06

  本文關(guān)鍵詞：核酸探針電致化學(xué)發(fā)光生物傳感器檢測(cè)土壤中鉛離子的研究

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【摘要】：重金屬離子具有生物毒性大、易被生物富集、難于自然降解等的特點(diǎn),嚴(yán)重危害生態(tài)環(huán)境和人類生命健康,而傳統(tǒng)檢測(cè)方法多依賴大型儀器,存在檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng),靈敏度相對(duì)較低等缺點(diǎn),因此探索建立快速、靈敏、低成本的痕量重金屬分析檢測(cè)方法有重要意義。電致化學(xué)發(fā)光(ECL)結(jié)合了發(fā)光分析的高靈敏度和電化學(xué)分析的高可控性,具有重現(xiàn)性好、靈敏度高和選擇性好等優(yōu)點(diǎn),可顯著提高分析檢測(cè)靈敏度和選擇性,尤其適用于被測(cè)物濃度低,組分復(fù)雜,干擾物多的環(huán)境樣品。本論文以土壤中Pb~(2+)的檢測(cè)為研究模型,利用具有高選擇性的核酸探針為識(shí)別元件,從信號(hào)輸出模式、ECL體系、核酸放大技術(shù)等多方面著手,并進(jìn)一步結(jié)合多種復(fù)合納米材料,設(shè)計(jì)構(gòu)建了多種高靈敏ECL檢測(cè)Pb~(2+)的新方法。研究結(jié)果為污染土壤Pb~(2+)的快速、靈敏的檢測(cè)提供了一個(gè)新的思路和方法,有利于提高Pb~(2+)的檢測(cè)精度,在土壤、水環(huán)境分析實(shí)踐中具有十分重要的意義。主要研究結(jié)果如下:1.基于聚乙烯亞胺還原的金納米顆粒固載核酸探針的“signal on”型ECL傳感器的研究本實(shí)驗(yàn)結(jié)合目標(biāo)物循環(huán)與雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(HCR)信號(hào)放大策略構(gòu)建了Pb~(2+)ECL生物傳感器。該傳感器可以通過Pb~(2+)和脫氧核酶(LC)的特異識(shí)別作用,并結(jié)合目標(biāo)物循環(huán)和雜交鏈?zhǔn)?HCR)反應(yīng),在電極表面生成了大量由DNA雜交形成的長(zhǎng)雙鏈聚合物。這些雙鏈聚合物可以通過靜電吸附作用固載ECL信號(hào)分子鄰菲羅啉釕配合物。利用固載在電極基底的聚乙烯亞胺還原的金納米顆粒對(duì)發(fā)光試劑的共反應(yīng)作用顯著放大檢測(cè)信號(hào),構(gòu)建了對(duì)Pb~(2+)的“signal on”響應(yīng)模式ECL檢測(cè)新方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在Pb~(2+)濃度范圍為1×10-12 mol/L~1×10-7 mol/L(2.07×10-10 g/L~2.07×10-5 g/L)之間,表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系,其檢出限為3.33×10-13 mol/L(6.89×10-11 g/L)。將該方法用于土壤樣品中鉛離子的檢測(cè),所得回收率介于98.7%~103%之間,說(shuō)明該傳感器對(duì)pb~(2+)的檢測(cè)良好的準(zhǔn)確度。2.基于分子間和分子內(nèi)共反應(yīng)雙重放大策略的“signalon”型ecl傳感器的研究本實(shí)驗(yàn)首先制備了多邊形的金納米顆粒(hifaunps)作為固載基質(zhì),聚酰胺-胺型樹枝狀高分子pamam既作為交聯(lián)分子又作為共反應(yīng)基團(tuán),通過酰胺反應(yīng)將發(fā)光試劑羧基化聯(lián)吡啶釕ru-cooh與pamam交聯(lián)到同一個(gè)分子內(nèi),制備了具有更高發(fā)光效率的自增強(qiáng)的ecl發(fā)光試劑作為ecl信標(biāo)。另一方面,將l-半胱氨酸(l-cys)和金納米顆粒電沉積到電極上,增大了電極的比表面積,用以固定大量端基為巰基的輔助探針(aps),同時(shí)l-cys與ru-cooh通過分子間共反應(yīng)增強(qiáng)了ecl信號(hào),從而實(shí)現(xiàn)了分子間和分子內(nèi)共反應(yīng)雙重信號(hào)放大策略。當(dāng)pb~(2+)存在時(shí),pb~(2+)與固載到電極界面的捕獲探針(cps)形成了穩(wěn)定的g-四鏈體,誘導(dǎo)雙鏈dna釋放cps。電極上的aps進(jìn)一步捕獲信標(biāo)產(chǎn)生ecl信號(hào),pb~(2+)濃度越大,ecl響應(yīng)越強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,該方法具有較好的選擇性和穩(wěn)定性,其線性范圍為1.0×10-13mol/l~1.0×10-7mol/l(2.07×10-11g/l~2.07×10-5g/l),檢出限為3.33×10-14mol/l(6.89×10-12g/l)。用ecl適體傳感器和傳統(tǒng)的石墨爐原子吸收光譜法(gf-aas)對(duì)相同的土壤樣品進(jìn)行檢測(cè),兩種方法之間具有較好的一致性,證明該傳感器在檢測(cè)環(huán)境土壤中痕量的pb~(2+)很有應(yīng)用潛力。3.基于金/石墨烯/c60納米復(fù)合材料為固載基質(zhì)的“signaloff”型ecl傳感器的研究本實(shí)驗(yàn)制備了分子內(nèi)自增強(qiáng)ecl分子pamam-ru作為發(fā)光物質(zhì)直接標(biāo)記對(duì)鉛離子有特異識(shí)別作用的脫氧核酶8-17dnazyme的底物鏈。該分子通過分子內(nèi)的相互作用及快速電子傳遞,極大地提高了ecl試劑的發(fā)光效率及穩(wěn)定性。另一方面,制備了納米金功能化的石墨烯和c60的復(fù)合物(au@rgo-c60),利用該納米復(fù)合材料自身的大比表面積固載大量的8-17dnazyme使其與底物鏈結(jié)合形成pb~(2+)特異剪切位點(diǎn),同時(shí)由于其自身具有促進(jìn)電子傳遞作用進(jìn)一步放大響應(yīng)信號(hào)。當(dāng)測(cè)試溶液中含有s2o82-作為分子間共反應(yīng)試劑時(shí),與pamam分子內(nèi)自增強(qiáng)作用相結(jié)合實(shí)現(xiàn)雙重信號(hào)放大,獲得較強(qiáng)的初始信號(hào)。當(dāng)pb~(2+)存在時(shí),識(shí)別特異的剪切位點(diǎn),從而使結(jié)合到電極表面的pamam-ru離開電極,ecl信號(hào)顯著降低,構(gòu)建了“signaloff”型ecl鉛離子傳感器。其檢測(cè)范圍為1.0×10-15mol/l~1.0×10-8mol/l(2.07×10-13g/l~2.07×10-6g/l),檢測(cè)限為3.33×10-16mol/l(6.89×10-14g/l)。將制備的傳感器用于實(shí)際土壤樣品中pb~(2+)的檢測(cè),并采用標(biāo)準(zhǔn)加入法對(duì)傳感器回收率進(jìn)行了測(cè)定,所得回收率介于96.2%~103%之間,說(shuō)明傳感器具有較好的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。4.基于碳量子點(diǎn)/石墨烯復(fù)合納米材料為固載基質(zhì)和金納米顆粒為增強(qiáng)探針的“signal on-off”型ECL傳感器的研究本實(shí)驗(yàn)以C60作為新型碳源,利用強(qiáng)酸氧化法加熱回流合成法制得碳量子點(diǎn)(CQDs)為ECL發(fā)光試劑,并通過交聯(lián)作用將CQDs固載到氨基功能化的石墨烯納米材料表面。基于堿基的互補(bǔ)配對(duì)原則在電極表面引入標(biāo)記了金納米粒子的鉛離子適體探針互補(bǔ)鏈(CDNA),以增強(qiáng)適體傳感器的ECL響應(yīng),制得Pb~(2+)適體傳感器。當(dāng)有目標(biāo)物Pb~(2+)存在時(shí),Pb~(2+)與其適體鏈形成G四鏈體結(jié)構(gòu),釋放出金納米粒子標(biāo)記的增強(qiáng)探針,從而使得ECL信號(hào)減小。該傳感器的檢測(cè)范圍為1.0×10-13 mol/L~1.0×10-3 mol/L(2.07×10-11 g/L~2.07×10-1 g/L),檢測(cè)限為3.3×10-11mol/L(6.89×10-12 g/L)。該ECL適體傳感器對(duì)實(shí)際土壤樣品中的Pb~(2+)進(jìn)行檢測(cè),其回收率在98.8-105%。5.基于溶解氧/過硫酸根為ECL體系和卟啉鐵/G-四鏈體為猝滅探針構(gòu)建“signal on-off-on”型傳感器的研究為了降低背景信號(hào)以增加靈敏度,本實(shí)驗(yàn)利用“signal on-off-on”型檢測(cè)模式構(gòu)建超靈敏ECL鉛離子傳感器。首先利用金納米粒子的促進(jìn)電子傳遞作用得到S2O82-的超高信號(hào)作為初始“signal-on”信號(hào)。接著利用線性滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)得到一條與環(huán)形DNA模板互補(bǔ)的具有大量G堿基的酶鏈序列,使之與氯化血紅素結(jié)合形成hemin/G-四鏈體結(jié)構(gòu),它的存在導(dǎo)致S2O82-電致化學(xué)發(fā)光猝滅,得到較低ECL信號(hào)的“signal-off”的狀態(tài)。而當(dāng)體系中出現(xiàn)Pb~(2+)時(shí),Pb~(2+)剪切掉互補(bǔ)底物鏈探針,進(jìn)而使hemin/G-四鏈體離開電極表面,從而引起ECL信號(hào)的恢復(fù)。因此“on-off-on”檢測(cè)最終信號(hào)與目標(biāo)物Pb~(2+)的濃度成正比,可以得到超靈敏的Pb~(2+)傳感器。該傳感器的線性響應(yīng)范圍為1×10-12~1×10-7mol/L(2.07×10-10 g/L~2.07×10-5 g/L),并且具有良好的再生性能。本文的主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn)在于(1)提出了結(jié)合分子間和分子內(nèi)共反應(yīng)試劑放大響應(yīng)信號(hào)的雙重信號(hào)放大策略,為進(jìn)一步提高電致化學(xué)發(fā)光分析土壤中Pb~(2+)的靈敏度和降低檢測(cè)限提供了有益的嘗試。(2)首次利用hemin與Pb~(2+)與Pb~(2+)適體探針?biāo)逆滙w結(jié)構(gòu)的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合作用,構(gòu)建了“signal-on-off-on”型信號(hào)響應(yīng)模式實(shí)現(xiàn)了對(duì)土壤中Pb~(2+)的電致化學(xué)發(fā)光分析檢測(cè),該方法可簡(jiǎn)便、高效的降低背景信號(hào),使得在提高靈敏度的同時(shí)也增強(qiáng)了檢測(cè)的特異性。
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：X833;S151.93

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本文編號(hào)：1275068