本文關(guān)鍵詞：試劑級藻藍(lán)蛋白提取純化工藝研究及光譜分析

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【摘要】：藻藍(lán)蛋白是藍(lán)藻的一種胞內(nèi)蛋白,具有良好的抗氧化性、抗炎性、抗癌性和熒光性,在食品、化妝品和醫(yī)藥行業(yè)具有良好的應(yīng)用價值。藻藍(lán)蛋白按照純度不同可分為食品級、醫(yī)藥級和試劑級,純度越高,價值越大。目前,以巢湖藍(lán)藻為處理對象提取純化試劑級藻藍(lán)蛋白的研究很少,還基本停留在實驗室研究過程中,試劑級藻藍(lán)蛋白的提取純化工藝技術(shù)組合方式的研究也不夠系統(tǒng)化。因此,本文的基本思路是,以巢湖水華新鮮藍(lán)藻為處理對象,實驗探索巢湖水華新鮮藍(lán)藻中藻藍(lán)蛋白的提取純化的工藝技術(shù),建立試劑級藻藍(lán)蛋白提取純化的組合工藝技術(shù)方案,建立一定規(guī)模的中試生產(chǎn)線,掌握擴(kuò)大規(guī)模生產(chǎn)的基本運(yùn)行參數(shù),并運(yùn)用紫外-可見吸收光譜法,分析試劑級藻藍(lán)蛋白提取純化工藝組合的純化機(jī)理,為巢湖水華藍(lán)藻高附加值資源化的研究提供支撐。具體研究內(nèi)容與結(jié)果有:(1)通過對巢湖水華藍(lán)藻資源化的調(diào)查,綜合分析比較了藍(lán)藻資源化的幾個方向,將藍(lán)藻資源化劃分為一般附加值、較高附加值和高附加值三個方向,綜合比較得出藻藍(lán)蛋白的提取純化是藍(lán)藻高附加值資源化研究的一個重要方面。另外,系統(tǒng)性比較了藻藍(lán)蛋白提取技術(shù)和純化技術(shù),并結(jié)合理論分析和實際情況,預(yù)先選擇了藻藍(lán)蛋白提取純化基本技術(shù)路線,為實驗研究的開展提供了先期指導(dǎo)。(2)凍融法破壁提取獲得藻藍(lán)蛋白粗提液的實驗室研究結(jié)果表明,藍(lán)藻含水率為96.5%,冷凍溫度為-20℃,0.75%(W/V)的磷酸鹽緩沖液作為凍融介質(zhì),開展凍融實驗2次,破壁獲得的藻藍(lán)蛋白粗提液純度和得率達(dá)到最大值,分別為0.451和3.73%�？紤]中試放大的實際情況,直接選擇打撈的含水率約96%的水華新鮮藍(lán)藻為處理對象,選擇凍融溫度在-15℃以下,凍融次數(shù)為1次,直接選取凍融介質(zhì)為去離子水的條件進(jìn)行中試實驗,減少操作步驟,簡化操作方式,獲得的藍(lán)藻破壁粗提液中藻藍(lán)蛋白得率3%,純度0.35,說明了中試實驗中采用凍融法破壁具有良好效果。(3)六步分段鹽析法純化藻藍(lán)蛋白的實驗結(jié)果表明,奇數(shù)次鹽析(NH4)2SO4的摩爾濃度可選擇1.0 mol/L,偶數(shù)次鹽析(NH4)2SO4摩爾濃度可選擇1.8mol/L。另外,經(jīng)二步鹽析獲得的藻藍(lán)蛋白純度上升為2.26,回收率為77.38%。經(jīng)四步鹽析獲得的藻藍(lán)蛋白純度上升為3.48,回收率為54.92%。經(jīng)六步鹽析獲得的藻藍(lán)蛋白純度上升為3.71,回收率為45.98%。借助于紫外-可見吸收光譜法分析發(fā)現(xiàn),一步鹽析的主要作用在于去除了雜蛋白、少量未完全去除的細(xì)胞壁殘渣、少量的核酸類物質(zhì)和維生素類等淺黃色物質(zhì),二步鹽析能大量去除大量核酸類和維生素類物質(zhì),三步鹽析能繼續(xù)去除少量核酸類和部分其他蛋白質(zhì),四步鹽析主要是進(jìn)一步去除其他蛋白對藻藍(lán)蛋白的影響,五步和六步鹽析導(dǎo)致了同時損失了部分藻藍(lán)蛋白和別藻藍(lán)蛋白,但不能將這兩種性質(zhì)相近的蛋白質(zhì)分離開。(4)兩步分段鹽析聯(lián)合柱層析法精致純化藻藍(lán)蛋白的實驗結(jié)果表明,兩步分段鹽析后,先接纖維素(Cellufine A-500),再接羥基磷灰石(HA)柱層析能獲得純度大于4.0以上的藻藍(lán)蛋白。將兩步鹽析后獲得的藻藍(lán)蛋白溶液先過Cellufine A-500層析柱,上樣體積占柱床體積的2/3,以20mmol/L、pH=6.5的磷酸鹽緩沖液進(jìn)行無梯度洗脫,再采用20mmol/L、pH=6.5的磷酸鹽緩沖液溶液分別加入0.1、0.3、1.5mol/L NaCl進(jìn)行分級梯度洗脫,洗脫流速為6ml/min,藻紅蛋白先洗脫出來。將后洗脫組分再過HA層析柱,使1/3-2/3柱床著色,先以10mmol/L、pH=7.0的磷酸鹽緩沖液進(jìn)行無梯度洗脫,再采用20、50、100mmol/L、pH=7.0的磷酸鹽緩沖液溶液并加入0.1mol/L NaCl進(jìn)行分級梯度洗脫,洗脫流速為4ml/min,藻藍(lán)蛋白先洗脫出來,后洗脫出的組分主要成分為別藻藍(lán)蛋白,獲得的兩種蛋白質(zhì)的純度均大于4.0。(5)利用紫外-可見吸收光譜法掃描兩步鹽析聯(lián)合兩步柱層析各階段的藻藍(lán)蛋白溶液和去除或分離的雜質(zhì)液,可以明顯發(fā)現(xiàn),一步Cellufine A-500柱層析主要作用在于先將藻紅蛋白分離出來。第二步HA柱層析的主要作用在于將藻藍(lán)蛋白和別藻藍(lán)蛋白分離開,先出組分為藻藍(lán)蛋白,后出組分為別藻藍(lán)蛋白。經(jīng)四步純化組合工藝后,藻藍(lán)蛋白溶液在紫外區(qū)的吸收譜帶中,最大吸收峰逐步從260nm、269nm、277nm紅移至280nm。在可見光區(qū)的吸收譜帶中,最大吸收峰逐步從617nm、618nm紅移至620nm,藻藍(lán)蛋白溶液純度逐步上升。(6)藻藍(lán)蛋白中試提取純化工藝組合方式選定為一步凍融法破壁獲得藻藍(lán)蛋白粗提液-一步二級膜去渣濃縮獲得食品級藻藍(lán)蛋白溶液-兩步分段鹽析一般純化獲得藥品級藻藍(lán)蛋白溶液-兩步柱層析精致純化獲得試劑級藻藍(lán)蛋白溶液,該單元式組合提取純化工藝具有良好的效果,同時獲得了純度大于4.0以上的藻藍(lán)蛋白和別藻藍(lán)蛋白。將藻藍(lán)蛋白溶液進(jìn)行了紫外-可見光譜掃描、電泳鑒定和熒光分析,結(jié)果表明,純度大于4.0以上的試劑級藻藍(lán)蛋白具有良好的光譜吸收特性和熒光性。
【學(xué)位授予單位】：合肥工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：TQ936

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