本文關鍵詞：青稞查爾酮合酶基因的克隆與原核表達

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【摘要】：青稞(Hordeum vulgare L. var. nudum Hook. F)是我國青藏高原地區(qū)對多棱裸粒大麥的統(tǒng)稱,即裸大麥。青稞不僅屬于“三高兩低”(高蛋白、高纖維、高維生素、低脂肪和低糖)食品,更含有豐富的功能活性成分如黃酮類化合物、γ-氨基丁酸、多酚類化合物、B族維生素以及β-葡聚糖等,這些營養(yǎng)物質(zhì)對人的身體具有保健作用。隨著人民生活水平的提高,青稞的營養(yǎng)價值亦受到更加重視。黃酮是植物中一類重要的次生代謝產(chǎn)物,具有抗氧化、清除自由基、提高免疫力、防止骨質(zhì)疏松、保護肝臟等藥理作用,是人們的理想保健物質(zhì)。黃酮在植物中主要有黃酮、黃酮醇、黃烷酮、異黃酮等十幾類,青稞中主要以黃酮醇為主。查爾酮合酶(CHS)為黃酮代謝途徑的第一個關鍵限速酶,廣泛分布在植物界,并且在植物的生長和適應環(huán)境活動中起著重要作用,近年來也成為分子生物學及植物生理學的研究熱點之一。為了了解黃酮代謝途徑中相關酶基因的作用,本實驗以青稞“94-19-1”為材料,采用同源克隆的方式,克隆出了青稞查爾酮合酶基因的編碼序列(Coding sequence,CDS)全長,并構建載體pET-32a-HvCHS,進行原核表達得到了其融合蛋白。本實驗主要結果如下：1.采用同源克隆的方法獲得了青稞CHS的CDS全長序列,全長為1351 bp,該序列包含一個完整的開放閱讀框(ORF)1197bp,該ORF編碼398個氨基酸。序列分析表明：該基因編碼蛋白分子量43.4 KDa,等電點為預測等電點(PI)為5.92,是酸性蛋白,該酶蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)(Ⅱ)為40.10(大于40),屬于不穩(wěn)定蛋白,預測其半衰期為30 h,平均親水指數(shù)為-0.090,是親水性蛋白。2. Blastn對比分析結果表明：該全長序列與大麥同源性最高,達到99%,與普通小麥同源性為91%；與水稻同源性為88%。與玉米同源性為85%；與高粱同源性為78%；與葡萄、矮牽牛、橄欖、馬鈴薯、西紅柿等已知的CHS基因的同源性在65%-74%之間。進一步構建系統(tǒng)進化樹顯示青稞與單子葉植物的大麥、普通小麥的親緣關系最近,相對雙子葉植物如西紅柿等關系較遠。3.使用在線服務器PHYRE2 Server結合SOPMA軟件對HvCHS酶蛋白的二級結構進行預測,發(fā)現(xiàn)HvCHS酶蛋白的二級結構主要由α-螺旋(41%)、無規(guī)則卷曲(12%)、及β-轉(zhuǎn)角(15%)組成。進行蛋白質(zhì)的N-糖基化和N-磷酸化預測,沒有發(fā)現(xiàn)糖基化位點,卻具豐富的磷酸化位點,9個絲氨酸(Ser)、6個蘇氨酸(Thr)和2個酪氨酸(Tyr)存在磷酸化活性位點。4.將青稞CHS基因的編碼序列與表達載體pET-32a連接后在大腸桿菌BL21中進行原核表達,發(fā)現(xiàn)CHS基因編碼的蛋白與pET-32a表達載體上的標簽蛋白形成64 KDa左右的融合蛋白。對其表達條件進行優(yōu)化,發(fā)現(xiàn)融合蛋白最佳IPTG誘導濃度為1.0 mM,最佳誘導時間為3 h。
【關鍵詞】：大麥 青稞 查爾酮合酶 同源克隆 原核表達
【學位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S512.3;Q943.2
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-11
• 第一章 文獻綜述11-21
• 1 黃酮概述11-14
• 1.1 基本結構及分類11-12
• 1.2 生物學功能12-13
• 1.3 代謝途徑13-14
• 2 查爾酮合酶(Chalcone synthase,CHS)14-18
• 2.1 查爾酮合酶蛋白結構及反應機理14-16
• 2.2 查爾酮合成酶基因結構16
• 2.3 查爾酮合成酶基因的進化16-17
• 2.4 查爾酮合成酶基因表達的調(diào)控17
• 2.5 查爾酮合成酶基因的轉(zhuǎn)基因應用17-18
• 3 大麥(青稞)18-19
• 4 實驗目的與意義及研究內(nèi)容19-21
• 第二章 青稞查爾酮合酶基因的克隆21-35
• 1. 材料與方法21-27
• 1.1 材料21-22
• 1.1.1 材料與菌株21
• 1.1.2 主要試劑與藥品21
• 1.1.3 試劑的配置21-22
• 1.1.4 主要儀器22
• 1.2 方法22-27
• 1.2.1 總RNA的提取22-23
• 1.2.2 總RNA的純度和濃度的檢測23
• 1.2.3 第一鏈cDNA的制備23-24
• 1.2.4 PCR擴增24
• 1.2.5 PCR產(chǎn)物的克隆24-25
• 1.2.6 目的片段回收25
• 1.2.7 連接與轉(zhuǎn)化25-26
• 1.2.8 陽性克隆的篩選和鑒定26-27
• 2 結果與分析27-33
• 2.1 RNA完整性和純度檢測27
• 2.2 同源克隆27-28
• 2.2.1 PCR擴增產(chǎn)物27-28
• 2.3 生物信息學分析28-33
• 2.3.1 堿基序列分析28-29
• 2.3.2 氨基酸序列分析29-30
• 2.3.3 HvCHS蛋白一二級結構分析30-32
• 2.3.4 HvCHS蛋白三級結構分析32-33
• 3 討論33-35
• 3.1 RNA的提取33
• 3.2 青稞查爾酮合酶基因的同源克隆33-35
• 第三章 青稞查爾酮合酶基因的原核表達35-46
• 1 材料與方法35-41
• 1.1 材料35-36
• 1.1.1 質(zhì)粒與菌株35
• 1.1.2 主要試劑35
• 1.1.3 試劑的配置35-36
• 1.1.4 實驗儀器36
• 1.2 方法36-41
• 1.2.1 CHS基因酶切引物設計36-37
• 1.2.2 PCR擴增37
• 1.2.3 PCR產(chǎn)物回收純化37
• 1.2.4 CHS基因與T載體連接37
• 1.2.5 CHS基因轉(zhuǎn)化與鑒定37
• 1.2.6 原核表達載體的構建37-39
• 1.2.7 重組蛋白的誘導表達39-40
• 1.2.8 SDS-PAGE電泳40-41
• 2 結果41-43
• 2.1 雙酶切41-42
• 2.2 青稞CHS基因的原核表達42-43
• 2.3 青稞CHS基因的原核表達條件的優(yōu)化43
• 3 討論43-46
• 3.1 原核表達載體43-44
• 3.2 載體構建44-45
• 3.3 青稞HvCHS基因表達蛋白45-46
• 第四章 結論與展望46-48
• 1 結論46
• 2 展望46-48
• 參考文獻48-55
• 致謝55-57
• 攻讀碩士期間發(fā)表的學術論文57

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