發(fā)布時間：2017-09-17 02:36

  本文關鍵詞：1型鴨甲肝病毒VP2和VP4蛋白原核表達及間接ELISA檢測方法的建立

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【摘要】：鴨甲肝炎病毒(Duck Hepatitis Virus,DHAV)能引起雛鴨爆發(fā)鴨病毒性肝炎,其具有發(fā)病急、病程短、傳播迅速、病死率高等特點,臨床上主要表現(xiàn)為食欲減退、神經癥狀、突然死亡和肝臟腫大出血,又稱歪脖病。目前幾乎遍布世界各個養(yǎng)鴨國家和地區(qū),給養(yǎng)鴨業(yè)帶來了較大的經濟損失。DHAV可分為DHAV-1、 DHAV-2和DHAV-3三個基因型。本研究主要針對DHAV-1的VP2. VP4基因分別進行了分子特性分析、原核表達和基于兩種蛋白的間接ELISA檢測方法的建立等研究,主要結果如下：1.Ⅰ型鴨甲肝病毒VP2、VP4基因的生物信息學分析和原核表達根據(jù)本試驗室GenBank中提交的1型鴨甲肝病毒H株(登錄號JQ301467.1)序列及專業(yè)的蛋白的切割位點預測軟件NetPicoRna V1.0分析獲得DHAV-H VP2、VP4基因序列,大小分別為543bp.225bp,分別編碼181、75個氨基酸,分子量分別約為20.6KDa和7.7 kDa,VP2、VP4分別含有4個和1個N-豆蔻�；稽c、3個和1個N-糖基化位點、均含有3個酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點,抗原位點較多。經RT-PCR擴增、T克隆和亞克隆,成功構建了原核表達重組質粒pProEx-HTb-VP2和pET32c(+)-VP4,分別轉化到宿主菌BL21,經表達條件優(yōu)化,得出在37℃、0.2mmol/L IPTG誘導8h,VP2重組蛋白可在宿主菌中以包涵體形式大量表達,經切膠純化得到較純的VP2重組蛋白。在37℃、0.6mmol/L IPTG誘導4h,VP4重組蛋白可在宿主菌中以可溶性形式表達,經Ni2+NTA柱純化得到純度較高的VP4重組蛋白。兩種重組蛋白均與能被兔抗DHAV-1血清識別,具有很好的反應原性。2.基于VP2、VP4重組蛋白Ⅰ型鴨甲肝病毒的ELISA方法的建立分別以純化的VP2、VP4重組蛋白為包被抗原并對包被條件、封閉條件、血清孵育條件、酶標抗體孵育條件及顯色時間等的優(yōu)化,分別建立了基于VP2、VP4重組蛋白的ELISA檢測方法。結果顯示,以VP2重組蛋白為包被抗原的ELISA最優(yōu)檢測條件為：以2.713μg/ml (100μl)的VP2重組蛋白4℃包被過夜,以5%脫脂奶粉作為封閉液37。C封閉1h,血清1：40稀釋于37℃孵育2 h,HRP標記的兔抗鴨IgG以1：2000稀釋于37℃孵育2h,TMB顯色10 min為最佳檢測條件,確定的陽性閾值為0.359。以VP4重組蛋白為包被抗原的ELISA最優(yōu)檢測條件為：以3.375μg/ml (100μl的VP4重組蛋白37℃3h后4℃過夜包被,以1%脫脂奶粉作為封閉液37℃封閉1h,血清1：80稀釋于37℃孵育2h,HRP標記的羊抗鴨IgG以1：1600稀釋于37℃孵育0.5 h,TMB顯色30 min為最佳檢測條件,確定的陽性閾值為0.203。建立的兩種ELISA方法具有良好的特異性、重復性及靈敏度,與Ⅰ型鴨甲肝病毒為包被抗原的ELISA檢測方法的符合率較高,分別為91.1%和70.5%,可用于DHAV-1血清抗體的檢測。
【關鍵詞】：Ⅰ型鴨甲肝病毒 VP2和VP4基因原核表達 間接ELISA方法建立
【學位授予單位】：四川農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S852.65
【目錄】：

• 中文摘要3-5
• Abstract5-8
• 縮略詞及符號表8-11
• 一 引言11-15
• 1 小RNA病毒VP2、VP4蛋白的研究進展11-13
• 1.1 小RNA病毒概述11
• 1.2 小RNA病毒VP211-12
• 1.3 小RNA病毒VP412-13
• 2 鴨病毒性肝炎的概述13-14
• 3 1型鴨甲肝病毒血清抗體診斷方法14-15
• 4 選題的目的及意義15
• 二 試驗研究15-54
• 1 試驗材料15-18
• 1.1 毒株、菌種及鴨胚15
• 1.2 主要試劑15-16
• 1.3 主要溶液的配制16-17
• 1.3.1 基因克隆、表達相關試劑16-17
• 1.3.2 Western-blot、蛋白質純化相關試劑的配制17
• 1.3.3 ELISA相關溶液的配制17
• 1.4 主要儀器17-18
• 2 方法18-29
• 2.1 VP2、VP4基因的克隆、表達18-26
• 2.1.1 引物設計18-19
• 2.1.2 VP2、VP4基因及蛋白的生物信息學分析19
• 2.1.3 DHAV-1病毒增殖及基因組RNA的提取19
• 2.1.4 VP2、VP4基因的RT-PCR擴增19-20
• 2.1.5 VP2、VP4基因的克隆20-21
• 2.1.6 VP2、VP4基因重組原核表達質粒的構建及鑒定21-23
• 2.1.7 重組蛋白VP2、VP4的誘導表達及條件優(yōu)化23-24
• 2.1.8 重組蛋白VP2、VP4的鑒定及純化24-26
• 2.2 基于VP2、VP4蛋白間接ELISA檢測方法的建立26-29
• 2.2.1 間接ELISA的基本操作程序26
• 2.2.2 抗原的最佳包被濃度和陰陽性血清最佳稀釋度的確定26-27
• 2.2.3 酶標二抗最佳工作濃度的確定27
• 2.2.4 最佳包被條件27
• 2.2.5 最佳封閉條件確定27
• 2.2.6 血清及酶標二抗孵育時間確定27
• 2.2.7 顯色時間確定27-28
• 2.2.8 陰陽性臨界值的確定28
• 2.2.9 重復性試驗28
• 2.2.10 特異性試驗28
• 2.2.11 ELISA方法敏感性檢測28
• 2.2.12 基于VP2、VP4蛋白ELISA檢測方法的應用及與基于DHAV-1的ELISA方法符合率計算28-29
• 3 試驗結果29-49
• 3.1 VP2、VP4基因的克隆、表達29-37
• 3.1.1 VP2、VP4的生物信息學分析29-32
• 3.1.2 VP2、VP4基因的擴增和克隆32-33
• 3.1.3 原核表達重組質粒的構建與鑒定33-34
• 3.1.4 VP2、VP4重組蛋白的誘導表達及條件優(yōu)化34-36
• 3.1.5 VP2、VP4重組蛋白的鑒定與純化36-37
• 3.2 基于VP2、VP4蛋白的ELISA方法的建立37-49
• 3.2.1 抗原的最佳包被濃度和血清最佳稀釋度的確定37-38
• 3.2.2 最佳酶標二抗稀釋度38-39
• 3.2.3 最佳包被條件39
• 3.2.4 最佳封閉液選擇39-40
• 3.2.5 封閉時間40-41
• 3.2.6 最佳血清孵育時間及最佳酶標二抗孵育時間41
• 3.2.7 顯色時間41-42
• 3.2.8 陰陽性臨界值的確定42-43
• 3.2.9 重復性試驗43-44
• 3.2.10 特異性檢驗44-46
• 3.2.11 敏感性檢測46-47
• 3.2.12 基于VP2、VP4蛋白ELISA檢測方法的應用及與基于DHAV-1的ELISA方法符合率計算47-49
• 4 討論49-54
• 4.1 VP2、VP4基因的克隆表達49-51
• 4.2 基于VP2、VP4蛋白間接ELISA檢測方法的建立51-54
• 三 結論54-55
• 參考文獻55-59
• 致謝59

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