本文關鍵詞：產多酚氧化酶茶葉內生真菌的篩選及酶的分離純化

  更多相關文章： 內生真菌 多酚氧化酶 菌株篩選 發(fā)酵優(yōu)化 分離純化 HPLC

【摘要】：多酚氧化酶(Polyphenol Oxidase, PPO)是一類銅蛋白,能有效地催化多酚類化合物氧化形成相應的醌類物質,在含酚廢水處理、木質素降解以及染料脫色等領域得到較好的研究和應用,具有廣泛的應用前景。茶葉細胞中富含多酚化合物和多酚氧化酶,在茶葉體內生物合成和制茶過程中的物質轉化中起重要作用,是紅茶和黑茶風味和特質形成的物質基礎。本論文以分離自健康茶葉組織的內生真菌為材料,篩選產多酚氧化酶的菌株,研究菌株的培養(yǎng)條件,分離純化多酚氧化酶,并應用于茶多酚的生物轉化,為茶樹內生真菌及其多酚氧化酶的利用打下基礎。利用平板顯色初篩和搖瓶復篩,從14株內生真菌菌株篩選出相對高產多酚氧化酶的菌株CSN-13,通過HPLC檢測茶多酚溶液的變化,進一步確定菌株CSN-13產多酚氧化酶的能力。通過形態(tài)學鑒定和真菌ITS序列分析,初步鑒定菌株CSN-13為茴麻鏈格孢(Alternaria abutilonis)。將菌株CSN-13作為出發(fā)菌株,利用單因素和響應面法分別對液體發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進行優(yōu)化,優(yōu)化后的酶活比優(yōu)化前分別提高了8.5倍和10倍。然后利用優(yōu)化后條件對菌株CSN-13進行液體發(fā)酵,通過硫酸銨鹽析沉淀、DEAE-陰離子交換層析、葡聚糖G-150凝膠層析等方法進行分離純化多酚氧化酶,將獲得的樣品通過SDS-PAGE凝膠電泳后,通過考馬斯亮藍R-250染色,顯示兩條清晰的蛋白條帶,相對分子量分別約為50 kDa和70 kDa。純化倍數為3.50倍,回收率為3.15%。對純化后的多酚氧化酶酶學性質進行研究,最適溫度為30℃,最適pH為5.5。通過優(yōu)化后確定產茶樹多酚氧化酶的固體發(fā)酵培養(yǎng)基,然后將固體發(fā)酵后產物和純化后的多酚氧化酶加入到一定濃度的茶多酚溶液中進行反應,通過HPLC檢測,發(fā)現多酚物質含量變化大且出現多個未知峰,表明固體發(fā)酵和液體發(fā)酵產酶均有生物轉化作用。
【關鍵詞】：內生真菌 多酚氧化酶 菌株篩選 發(fā)酵優(yōu)化 分離純化 HPLC
【學位授予單位】：福建師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：Q936
【目錄】：

• 中文摘要2-3
• Abstract3-5
• 中文文摘5-12
• 第一章 緒論12-26
• 1 多酚氧化酶概述12-16
• 1.1 多酚氧化酶的結構特點12
• 1.2 多酚氧化酶的分布和分類12-13
• 1.3 多酚氧化酶的催化機理13-14
• 1.4 多酚氧化酶的提取技術14-15
• 1.5 多酚氧化酶活力的測定15-16
• 2 多酚氧化酶分離和酶學性質16-19
• 2.1 多酚氧化酶分離純化的方法16-17
• 2.2 多酚氧化酶的酶學性質17-18
• 2.3 多酚氧化酶的同工酶18-19
• 3 多酚氧化酶的生理功能19-20
• 3.1 使高等植物組織發(fā)生褐變19
• 3.2 與植物抗病作用有關19
• 3.3 參與β-花青素的生物合成19
• 3.4 與綠色植物光合作用有關19
• 3.5 其他生理功能19-20
• 4 多酚氧化酶的應用20-21
• 4.1 多酚氧化酶在食品領域的應用20
• 4.2 多酚氧化酶在醫(yī)藥領域的應用20-21
• 4.3 多酚氧化酶在的其他方面的應用21
• 5 微生物多酚氧化酶應用21
• 6 多酚氧化酶與茶多酚21-22
• 7 研究的主要內容和意義22-26
• 7.1 本研究的主要內容22-23
• 7.2 技術路線23-26
• 第二章 茶葉中產多酚氧化酶真菌的篩選和鑒定26-38
• 2.1 前言26
• 2.2 材料26-28
• 2.2.1 菌種26
• 2.2.2 主要藥品及設備26-27
• 2.2.3 培養(yǎng)基及試劑的配制27-28
• 2.3 方法28-30
• 2.3.1 茶葉內生真菌菌的活化28
• 2.3.2 產多酚氧化酶內生真菌菌株初篩28
• 2.3.3 液體發(fā)酵復篩28-29
• 2.3.4 菌株形態(tài)觀察29
• 2.3.5 基因組DNA的提取29
• 2.3.6 PCR反應體系和擴增條件29-30
• 2.3.7 系統(tǒng)發(fā)育樹的構建30
• 2.4 結果與分析30-35
• 2.4.1 菌株的初篩30-31
• 2.4.2 液體發(fā)酵復篩31-33
• 2.4.3 CSN-13形態(tài)觀察33
• 2.4.4 菌株的ITS測序及系統(tǒng)發(fā)育樹構建33-35
• 2.5 小結與討論35-38
• 第三章 菌株CSN-13產多酚氧化酶培養(yǎng)條件優(yōu)化38-56
• 3.1 前言38
• 3.2 材料38-39
• 3.2.1 菌種38
• 3.2.2 主要試劑38
• 3.2.3 主要儀器設備38
• 3.2.4 培養(yǎng)基及試劑的配制38-39
• 3.3 方法39-40
• 3.3.1 菌種活化39
• 3.3.2 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化39
• 3.3.3 發(fā)酵條件優(yōu)化39-40
• 3.3.4 Plackett-Burman設計和響應面設計優(yōu)化40
• 3.4 結果與分析40-53
• 3.4.1 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化40-43
• 3.4.1.1 碳源對產酶的影響40
• 3.4.1.2 麩皮濃度對產酶的影響40-41
• 3.4.1.4 氮源對產酶的影響41
• 3.4.1.5 硝酸銨濃度對產酶的影響41-42
• 3.4.1.6 茶水對產酶的影響42
• 3.4.1.7 茶水濃度對產酶的影響42-43
• 3.4.2 發(fā)酵條件優(yōu)化43-45
• 3.4.2.1 培養(yǎng)時間對菌株CSN-13產多酚氧化酶的影響43
• 3.4.2.2 發(fā)酵溫度對產酶的影響43-44
• 3.4.2.3 初始pH對產酶的影響44
• 3.4.2.4 轉速對產酶的影響44-45
• 3.4.2.5 培養(yǎng)基和發(fā)酵條件優(yōu)化后菌株CSN-13產多酚氧化酶的動態(tài)變化45
• 3.4.3 Plackett-Burman設計和響應面設計優(yōu)化45-53
• 3.4.3.1 Plackett-Burman設計法篩選影響液體發(fā)酵產多酚氧化酶的顯著因子45-47
• 3.4.3.2 最陡爬坡實驗47-48
• 3.4.3.3 Box-Behnken響應面實驗設計與結果48-53
• 3.4.4 響應面優(yōu)化法最優(yōu)配方的驗證53
• 3.5 小結與討論53-56
• 第四章 多酚氧化酶的分離、純化和酶學性質研究56-70
• 4.1 前言56
• 4.2 材料56-58
• 4.2.1 菌種56
• 4.2.2 主要藥品及設備56-57
• 4.2.3 主要試劑的配制57-58
• 4.3 方法58-61
• 4.3.1 蛋白質含量測定58-59
• 4.3.2 多酚氧化酶酶活測定59
• 4.3.3 多酚氧化酶的分離純化59-60
• 4.3.3.1 粗酶液的提取59
• 4.3.3.2 硫酸銨分級沉淀59-60
• 4.3.3.3 DEAE-纖維素陰離子交換柱層析60
• 4.3.3.4 葡聚糖G-150凝膠柱層析60
• 4.3.3.5 SDS-PAGE凝膠電泳60
• 4.3.4 多酚氧化酶酶學性質的研究60-61
• 4.3.4.1 反應進程曲線60-61
• 4.3.4.2 最適pH值61
• 4.3.4.3 最適溫度61
• 4.3.4.4 最適底物濃度61
• 4.3.4.5 金屬離子對多酚氧化酶的影響61
• 4.4 結果與分析61-67
• 4.4.1 硫酸銨分級沉淀的確定61-62
• 4.4.2 DEAE-纖維素陰離子交換層析62
• 4.4.3 葡聚糖G-150凝膠柱層析62-63
• 4.4.4 多酚氧化酶各步純化結果63-64
• 4.4.5 多酚氧化酶催化反應的進程曲線64-65
• 4.4.6 多酚氧化酶的最適pH65
• 4.4.7 多酚氧化酶的最適溫度65-66
• 4.4.8 底物濃度對酶活力的影響66
• 4.4.9 金屬離子對多酚氧化酶活性的影響66-67
• 4.5 小結與討論67-70
• 第五章 菌株CSN-13多酚氧化酶對茶多酚生物轉化的初步研究70-82
• 5.1 前言70
• 5.2 材料70-72
• 5.2.1 菌種70
• 5.2.2 主要藥品及設備70-71
• 5.2.3 培養(yǎng)基及試劑的配制71-72
• 5.3 方法72-73
• 5.3.1 茶多酚對菌株CSN-13生長的影響72
• 5.3.2 菌株CSN-13發(fā)酵液對茶湯的“轉化”作用72
• 5.3.3 HPLC分析72-73
• 5.3.4 菌株CSN-13在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)及優(yōu)化73
• 5.4 結果與分析73-79
• 5.4.1 茶多酚對菌株CSN-13生長的影響73
• 5.4.2 菌株CSN-13粗酶液對茶湯的“轉化”作用73-74
• 5.4.3 粗酶液轉化茶多酚的HPLC分析74-77
• 5.4.4 菌株CSN-13在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)以及優(yōu)化77-78
• 5.4.5 固體發(fā)酵所產粗酶液對茶多酚的轉化效果78-79
• 5.5 小結與討論79-82
• 第六章 結論與展望82-86
• 6.1 結論82-83
• 6.2 問題及展望83-86
• 參考文獻86-94
• 攻讀學位期間承擔的科研任務與主要成果94-96
• 致謝96-98
• 索引98-100
• 個人簡歷100-104

【參考文獻】

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本文編號：697854