A型塞內卡病毒(Seneca VriusA,SVA)屬于小RNA病毒科塞內卡病毒屬,對豬具有傳染性和致病性。癥狀類似于口蹄疫、豬傳染性水皰病和豬水泡性口炎,成年豬感染初期出現嗜睡、厭食和發(fā)熱,隨后鼻鏡部、口腔上皮、舌和蹄冠等部位出現大小不一的水皰,嚴重者造成潰爛和跛行。7日齡以內的仔豬死亡率高達70%,偶爾伴有腹瀉癥狀。2014-2015年SVA給巴西養(yǎng)豬業(yè)造成嚴重經濟損失,同年SVA首次出現在我國廣東地區(qū),屬于新型外來病。常用檢測方法有病毒的分離鑒定、常規(guī)RT-PCR、熒光定量RT-PCR、病毒中和試驗、利用表達SVA蛋白構建ELISA等。SVA只有一個閱讀框,VP1、VP2和VP3構成該病毒的衣殼蛋白。研究表明,以VP2蛋白作為包被抗原的ELISA檢測方法其特異性和靈敏度優(yōu)于包被抗原為VP1蛋白或VP3蛋白。本試驗利用構建的SVA-VP2蛋白作為抗原,建立SVA血清抗體間接ELISA和均相光激化學發(fā)光免疫技術(AlphaLISA)檢測方法,為SVA-VP2蛋白的免疫原性的研究及SVA血清學檢測試劑盒和基因工程疫苗研究奠定基礎。本試驗根據SVA分離株GD01/2017中的VP2基因,...

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【學位級別】：碩士

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摘要
Abstract
英文縮寫對照
1 引言
    1.1 A型塞內卡病毒概述
        1.1.1 A型塞內卡病毒國內外的研究
        1.1.2 A型塞內卡病毒的傳播途徑和傳染源
        1.1.3 A型塞內卡病毒病的預防措施
        1.1.4 A型塞內卡病毒的檢測方法
    1.2 AlphaLISA檢測技術的研究進展
        1.2.1 均相光激化學發(fā)光免疫分析技術原理
        1.2.2 均相光激化學發(fā)光免疫分析技術特點
        1.2.3 均相光激化學發(fā)光免疫分析技術在生物醫(yī)學領域的研究
        1.2.4 均相光激化學發(fā)光免疫分析技術在食品安全領域的研究
        1.2.5 均相光激化學發(fā)光免疫分析技術在蛋白分子相互作用領域的研究
        1.2.6 均相光激化學發(fā)光免疫分析在疫病檢測領域的研究
    1.3 研究目的及意義
2 材料與方法
    2.1 試驗儀器
    2.2 試驗材料與試劑
        2.2.1 細胞與病毒
        2.2.2 載體、菌株與血清樣品
        2.2.3 試驗試劑與試劑盒
    2.3 主要試劑配制
        2.3.1 LB培養(yǎng)基制備
        2.3.2 細胞培養(yǎng)所需試劑的配制
        2.3.3 蛋白表達及純化所需試劑配制
        2.3.4 Western blotting所需試劑配制
        2.3.5 AlphaLISA檢測方法所用試劑配制
    2.4 A型塞內卡病毒VP2蛋白的原核表達與純化
        2.4.1 A型塞內卡病毒VP2基因重組質粒的構建
        2.4.2 原核表達載體的構建及VP2蛋白的誘導和純化
    2.5 A型塞內卡病毒血清抗體間接ELISA檢測方法的建立
        2.5.1 間接ELISA方法的操作流程
        2.5.2 間接ELISA方法條件的優(yōu)化
    2.6 A型塞內卡病毒AlphaLISA檢測方法建立
        2.6.1 抗原的生物素化
        2.6.2 抗體與受體微珠偶聯
        2.6.3 AlphLISA方法試驗步驟
        2.6.4 AlphaLISA方法的建立
3 結果
    3.1 A型塞內卡病毒VP2基因重組質粒的構建結果
        3.1.1 A型塞內卡病毒VP2片段的擴增結果
        3.1.2 重組質粒的鑒定結果
    3.2 原核表達載體的構建及VP2蛋白的誘導和純化結果
        3.2.1 蛋白的表達結果
        3.2.2 蛋白表達的優(yōu)化結果
        3.2.3 蛋白質可溶性分析
        3.2.4 蛋白純化
        3.2.5 Western-blot鑒定
        3.2.6 蛋白濃度測定
    3.3 A型塞內卡病毒抗體間接ELISA檢測方法的建立結果
        3.3.1 間接ELISA方法包被抗原和血清最佳反應條件的確定
        3.3.2 辣根過氧化物酶標記(HRP)的抗豬IgG反應的最佳稀釋濃度
        3.3.3 酶標二抗最佳反應時間的確定
        3.3.4 間接ELISA最佳顯色時間的確定
        3.3.5 間接ELISA臨界值的確定
        3.3.6 特異性試驗
        3.3.7 靈敏性試驗
        3.3.8 重復性試驗
        3.3.9 臨床樣品的檢測
    3.4 A型塞內卡病毒AlphaLISA檢測方法結果
        3.4.1 抗原和抗體最佳反應濃度
        3.4.2 靈敏度的檢測
        3.4.3 特異性試驗
        3.4.4 重復性試驗
4 討論
    4.1 豬A型塞內卡病毒及其危害
    4.2 A型塞內卡病毒VP2蛋白的原核表達與純化
    4.3 A型塞內卡病毒的檢測
5 結論
參考文獻
在讀期間發(fā)表的論文
作者簡歷
致謝
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本文編號：3748456