近年來,基因編輯技術CRISPR/Cas9在動植物中都得到了廣泛應用。在本研究中,利用CRISPR/Cas9基因組編輯技術,將與直鏈淀粉合成有關的顆粒結合型淀粉合成酶基因（Granule-Bound Starch SynthaseⅠ,GBSS I）作為基因組編輯的靶基因,以大西洋、隴薯三號和費烏瑞它作為試驗材料,通過基因槍轉化將體外合成的核糖核蛋白RNP和mRNA傳遞到外植體中,實現(xiàn)對靶基因的敲除,以獲得無外源DNA插入的馬鈴薯新品系。本研究以RNP為轉化試劑共獲得168株再生植株,其中有13株再生植株在靶位點處成功實現(xiàn)基因編輯,而以mRNA為轉化試劑的結果還未送測序。本實驗得到以下結論:1)以隴薯三號莖段作為外植體分化的愈傷組織,結構過于緊密,用基因槍轟擊的方式,未能將反應試劑傳遞到愈傷組織中;2)以費烏瑞它的莖段作為外植體分化形成的愈傷組織,由于結構松散,導致后期不能分化成苗;3)以大西洋葉片和葉片愈傷組織作為基因槍實驗的外植體,最終獲得GBSS I基因敲除的轉化株,基因編輯效率為0.039-0.36%。本研究說明基于CRISPR/Cas9的基因槍技術通過轉化RNP的方法可對馬鈴薯... 

【文章頁數(shù)】：84 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
縮略詞表
一 前言
    1.1 基因組編輯的現(xiàn)狀與發(fā)展
        1.1.1 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)
        1.1.2 CRISPR/Cpf1 系統(tǒng)
        1.1.3 CRISPR/Cas13 系統(tǒng)
    1.2 基因組編輯技術在植物中的研究進展
        1.2.1 基因敲除或插入
        1.2.2 單堿基誘變
        1.2.3 核酸內切酶介導的活細胞成像技術
    1.3 基因編輯技術在農(nóng)業(yè)育種上的應用與發(fā)展
        1.3.1 增加農(nóng)作物產(chǎn)量
        1.3.2 提升農(nóng)作物品質
        1.3.3 提高植物抗逆性
        1.3.4 加速雜交育種
    1.4 基因編輯在馬鈴薯上的研究進展
        1.4.1 降低馬鈴薯龍葵素含量
        1.4.2 改善低溫糖化現(xiàn)象
        1.4.3 馬鈴薯抗除草劑
        1.4.4 提高馬鈴薯支鏈淀粉含量
        1.4.5 馬鈴薯抗多酚氧化酶(PPO)
        1.4.6 馬鈴薯抗病毒
        1.4.7 馬鈴薯克服自交不親和
    1.5 無轉基因成分且無轉基因過程的基因組編輯
        1.5.1 無轉基因成分的基因組編輯
        1.5.2 無轉基因過程的基因組編輯
    1.6 研究目的和意義
    1.7 實驗創(chuàng)新性
        1.7.1 技術創(chuàng)新
        1.7.2 材料創(chuàng)新
二 材料與方法
    2.1 材料
        2.1.1 菌株和質粒
        2.1.2 試劑與工具酶
        2.1.3 實驗儀器和設備
    2.2 實驗方法
        2.2.1 載體構建
        2.2.2 陽性菌株檢測
        2.2.3 sgRNA體外轉錄及純化
        2.2.4 Cas9 mRNA體外轉錄及純化
        2.2.5 金粉懸濁液的配置
        2.2.6 RNP的金粉包裹
        2.2.7 RNA的金粉包裹
        2.2.8 基因槍轟擊
        2.2.9 馬鈴薯葉片基因槍轉化
        2.2.10 馬鈴薯葉片愈傷的基因槍轉化
        2.2.11 馬鈴薯葉片DNA的提取
        2.2.12 建立PCR產(chǎn)物混合池
        2.2.13 馬鈴薯試管苗的培養(yǎng)
三 結果
    3.1 CRISPR敲除載體構建
        3.1.1 載體構建
        3.1.2 RNA體外轉錄結果
    3.2 愈傷組織的培養(yǎng)
    3.3 基因槍預實驗
        3.3.1 馬鈴薯莖段愈傷組織基因槍轟擊預實驗結果
        3.3.2 馬鈴薯葉片愈傷組織基因槍預實驗結果
        3.3.3 馬鈴薯葉片組織的基因槍預實驗結果
    3.4 基因槍實驗
        3.4.1 馬鈴薯葉片愈傷組織基因槍實驗結果
        3.4.2 馬鈴薯葉片基因槍實驗結果
    3.5 PCR產(chǎn)物測序結果
四 討論
    4.1 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的改進與優(yōu)化
    4.2 基因槍轟擊技術的改進與優(yōu)化
五 結論
參考文獻
附錄
    附錄1 實驗方法
    附錄2 Barcode引物
    附錄3 培養(yǎng)基配制方法
    附錄4 公司合成序列
    附錄5 DNA提取及PCR產(chǎn)物結果圖
    附錄6 深度測序結果
致謝


【參考文獻】：
期刊論文
[1]堿基編輯系統(tǒng)研究進展[J]. 宗媛,高彩霞.  遺傳. 2019(09)
[2]基于體外組裝核糖核蛋白形式的CRISPR/Cas9基因編輯方法研究進展[J]. 潘海峰,楊晗,于思遠,李廷棟,葛勝祥.  中國生物工程雜志. 2019(01)
[3]CRISPR/Cas9-mediated base-editing system efficiently generates gain-of-function mutations in Arabidopsis[J]. Yiyu Chen,Zhiping Wang,Hanwen Ni,Yong Xu,Qijun Chen,Linjian Jiang.  Science China（Life Sciences）. 2017(05)
[4]新一代基因組編輯系統(tǒng)CRISPR/Cpf1[J]. 楊帆,李寅.  生物工程學報. 2017(03)
[5]Rapid improvement of grain weight via highly efficient CRISPR/Cas9-mediated multiplex genome editing in rice[J]. Rongfang Xu,Yachun Yang,Ruiying Qin,Hao Li,Chunhong Qiu,Li Li,Pengcheng Wei,Jianbo Yang.  Journal of Genetics and Genomics. 2016(08)
[6]Targeted Gene Manipulation in Plants Using the CRISPR/Cas Technology[J]. Dandan Zhang,Zhenxiang Li,Jian-Feng Li.  Journal of Genetics and Genomics. 2016(05)
[7]Targeted Mutagenesis in Zea mays Using TALENs and the CRISPR/Cas System[J]. Zhen Liang,Kang Zhang,Kunling Chen,Caixia Gao.  Journal of Genetics and Genomics. 2014(02)
[8]龍葵素在農(nóng)業(yè)上的應用[J]. 李紅梅,謝麥香.  山西農(nóng)業(yè). 2005(08)

碩士論文
[1]利用CRISPR/Cas9技術選育馬鈴薯低龍葵素、抗低溫糖化和支鏈淀粉高的新品系[D]. 趙國超.內蒙古大學 2019
[2]應用基因編輯技術抑制馬鈴薯多酚氧化酶的研究[D]. 陳明俊.貴州大學 2018



本文編號：3708335