目的:通過建立穩(wěn)轉細胞系,探究Ⅰ型（HSV1）和Ⅱ型（HSV2）基因產(chǎn)物對重組Ⅱ型單純皰疹病毒（o HSV2）復制的影響。方法:合成HSV1-ICP34.5和HSV2-ICP34.5基因序列,連接至Piggy Bac-Dual-promoter（PBDP）真核表達載體上,并通過測序進行確認。將重組真核表達載體轉染到Vero細胞和BHK細胞,構建表達ICP34.5基因的穩(wěn)轉細胞系。用熒光顯微鏡及流式細胞儀檢測綠色熒光蛋白（GFP,為穩(wěn)轉成功指示蛋白）的表達,用PCR擴增、實時熒光定量PCR及免疫印染來鑒定ICP34.5目的基因及表達。再用穩(wěn)轉細胞系來生產(chǎn)o HSV2病毒,通過CCID50方法檢測病毒滴度來評估ICP34.5蛋白對o HSV2復制的影響。結果:共獲得4種穩(wěn)轉細胞系,分別為VeroHSV1-ICP34.5、VeroHSV2-ICP34.5、BHKHSV1-ICP34.5和BHKHSV2-ICP34.5;4種新穩(wěn)轉細胞系于熒光顯微鏡下均能觀察到綠色熒光蛋白（GFP）的表達,流式檢測陽性細胞比例達到百分之九十以上;4種新穩(wěn)轉細胞系經(jīng)免疫印染檢測均能表達ICP34.5蛋白,用PCR... 

【文章來源】：湖北科技學院湖北省

【文章頁數(shù)】：44 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

重組質粒酶切產(chǎn)物

湖北科技學院碩士學位論文173.實驗結果3.1重組質粒酶切鑒定及質粒濃度測定圖1：重組質粒酶切產(chǎn)物圖2：重組質粒濃度測定將新構建的重組質粒PBDP-HSV1-ICP34.5和PBDP-HSV2-ICP34.5進行酶切鑒定，結果如圖1。從圖1可知，第二、第三、第四泳道都是重組質粒PBDP-HSV1-ICP34.5樣品，三個泳道均出現(xiàn)目的條帶；第七、第八、第九泳道都是重組質粒PBDP-HSV2-ICP34.5樣品，三個泳道均出現(xiàn)目的條帶。結果表明目的片段均成功插入真核表達載體PBDP。由其他生物公司幫助測序的結果表明，兩個構建的新重組質粒測序結果與HSV1-ICP34.5、HSV2-ICP34.5序列一致，表明成功構建重組質粒PBDP-HSV1-ICP34.5和PBDP-HSV2-ICP34.5。將構建的重組質粒PBDP-HSV1-ICP34.5和PBDP-HSV2-ICP34.5各取15μl，分別與3μlLoadingBuffer混勻，再按5μl、4μl、3μl、2μl、1μl的濃度梯度加入到凝膠孔中，MarKer加5μl和10μl，電泳結束后，如圖2所示。由圖2可知，第二至第六泳道都為PBDP-HSV1-ICP34.5樣品，并且條帶亮度依次降低；第八至第十二泳道都為PBDP-HSV2-ICP34.5樣品，并且條帶亮度依次降低。根據(jù)與MarKer條帶對比，可以計算出PBDP-HSV1-ICP34.5重組質粒濃度為80ng/μl，PBDP-HSV2-ICP34.5重組質粒濃度為50ng/μl。

湖北科技學院碩士學位論文193.3PCR鑒定穩(wěn)定表達ICP34.5的Vero細胞系和BHK細胞系圖7：PCR鑒定表達ICP34.5的Vero細胞系圖8：PCR鑒定表達ICP34.5的BHK細胞系將6種細胞（Vero、VeroHSV1-ICP34.5、VeroHSV2-ICP34.5、BHKHSV1-ICP34.5、BHK和BHKHSV2-ICP34.5）從液氮罐中復蘇，分別傳代至T75細胞培養(yǎng)瓶中，待細胞匯合度達80%-90%時，用DNAzol試劑提取六種細胞的DNA，用PCR法鑒定細胞DNA中是否含有ICP34.5基因，結果如圖7，圖8所示。從圖7可知，VeroHSV1-ICP34.5和陽性對照均出現(xiàn)目的條帶，大小為765bp，空白對照無條帶；VeroHSV2-ICP34.5和陽性對照均出現(xiàn)目的條帶，大小為804bp，空白對照無條，故VeroHSV1-ICP34.5細胞和VeroHSV2-ICP34.5細胞中均含有目的基因。從圖8可知，BHKHSV1-ICP34.5和陽性對照均出現(xiàn)目的條帶，大小為765bp，空白對照無條帶；BHKHSV2-ICP34.5和陽性對照均出現(xiàn)目的條帶，大小為804bp，空白對照無條帶，故BHKHSV1-ICP34.5細胞和BHKHSV2-ICP34.5細胞中均含有目的基因。

【參考文獻】：
期刊論文
[1]溶瘤病毒抗腫瘤的研究進展[J]. 陳瑩,劉濱磊.  中國新藥雜志. 2019(21)
[2]溶瘤病毒T-Vec應用于腫瘤治療的臨床研究進展[J]. 姚星妹,潘莉莉,吳婷.  中國腫瘤生物治療雜志. 2019(04)
[3]溶瘤病毒作為治療腫瘤新療法的探討[J]. 馮超,徐晨昶,劉睿,沈輝.  現(xiàn)代免疫學. 2018(06)
[4]溶瘤免疫治療的機遇與挑戰(zhàn)[J]. 魏繼武.  醫(yī)學研究生學報. 2018(07)
[5]Carrier Cells for Delivery of Oncolytic Measles Virus into Tumors:Determinants of Efficient Loading[J]. Chun Xu,Mao Xia,Gang Meng,Chunyan Li,Aiqin Jiang,Jiwu Wei.  Virologica Sinica. 2018(03)
[6]腫瘤治療的新突破:溶瘤病毒治療[J]. 喻啟桂.  安徽醫(yī)藥. 2018(01)
[7]新藥研究與開發(fā)[J]. 黃世杰.  國際藥學研究雜志. 2017(09)
[8]NK細胞應用于腫瘤免疫治療的研究進展[J]. 任海龍,邵東燕,李琦,師俊玲,楊慧,靳明亮,黃慶生.  現(xiàn)代免疫學. 2017(03)
[9]PD-1及PD-L1與腫瘤適應性免疫抵抗的研究進展[J]. 王一唯,吳霞.  現(xiàn)代免疫學. 2016(06)
[10]人用重組溶瘤單純皰疹病毒Ⅱ型（OH2）生物學特性的穩(wěn)定性[J]. 李延飛,毛澤勇,石曉太,鄒建文,董玉婷,孫美玲,劉濱磊,方志正.  中國生物制品學雜志. 2016(05)



本文編號：3602942