豬流行性腹瀉病毒（PEDV）流行株的序列分析和抗原表位表達
發(fā)布時間：2022-01-07 03:54
豬流行性腹瀉（PED）是以水樣腹瀉、脫水和嘔吐為臨床癥狀的一種高接觸性急性腸道傳染病,病原為豬流行性腹瀉病毒（PEDV）.豬流行性腹瀉病毒和傳染性胃腸炎病毒（TGEV）同屬冠狀病毒科（coronaviridae）冠狀病毒屬（coronavirus）的成員。PEDV可以誘使各種年齡段的豬發(fā)病,其中受它侵害最嚴重的是哺乳仔豬,可造成乳豬高達100%的發(fā)病率和死亡率。自2011年在我國暴發(fā)以來,該病已然成為世界流行性的疾病,是造成我國各地養(yǎng)殖場仔豬死亡的主要疫病之一,嚴重地危害養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展和養(yǎng)殖戶的經濟利益。因此,每年對PED的流行病學監(jiān)測和免疫預防是一項必不可少的任務,特別是通過分子生物學手段對PEDV的分子流行病學特征進行監(jiān)測,可使我們了解PEDV毒株的來源和變異程度及毒株之間的親緣關系,從而為該病的防控提供理論依據。針對于此,本論文進行了如下內容的研究：（1）利用RT-PCR和分子克隆等分子生物學技術對地方流行毒株SDZBCH2014進行了全基因測序,并使用CLUSTAL1.83和MAGE5軟件將該序列與來自我國、美國、韓國、加拿大等國的64株參考毒株進行比較分析...
【文章來源】：海南大學海南省 211工程院校
【文章頁數】：66 頁
【學位級別】：碩士
【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 綜述
1 PED的流行
1.1 國外流行情況
1.2 國內流行情況
2 PEDV的形態(tài)結構
3 PEDV的分類地位和分子特征
4 PED的診斷
4.1 RT-PCR法
4.2 ELISA法
4.3 免疫電鏡法
4.4 直接免疫熒光法
4.5 微量血清中和試驗
5 PED的治療
6 PED的疫苗研究
6.1 PED組織滅活苗
6.2 PED細胞滅活苗
6.3 PED弱毒苗
6.4 轉基因疫苗
6.4.1 植物疫苗
6.4.2 乳酸桿菌疫苗
7 選題的目的及意義
第二章 一株PEDV流行毒株全基因組的序列分析
1 材料與方法
1.1 樣品
1.2 主要試劑
1.3 主要儀器設備
1.4 引物設計
1.5 總RNA提取
1.6 獲得目的片段的方法
1.7 PEDV全基因的分析
1.8 參考序列
1.9 RT-PCR
1.9.1 RT-PCR擴增體系
1.9.2 RT-PCR擴增程序
1.10 PCR產物鑒定及純化回收
1.10.1 PCR產物鑒定
1.10.2 PCR產物的回收
1.11 PCR產物連接與轉化
1.11.1 連接
1.11.2 轉化
1.12 重組質粒提取、鑒定及序列測定
1.12.1 篩選菌落
1.12.2 堿裂解法提取質粒
1.12.3 重組質粒的鑒定
1.12.4 序列測定
2 結果
2.1 RT-PCR擴增結果
2.2 PEDV流行毒株SDZB_CH2014與64株參考毒株系統(tǒng)發(fā)育關系
2.3 S基因分析
2.3.1 S基因抗原性分析
2.3.2 S基因的B細胞線性表位分析
2.3.3 S基因的系統(tǒng)發(fā)育樹
2.4 ORF3系統(tǒng)發(fā)育關系樹
2.5 E基因系統(tǒng)發(fā)育關系樹
2.6 M基因系統(tǒng)發(fā)育關系樹
2.7 N基因系統(tǒng)發(fā)育關系樹
3 討論
第三章 2013-2014年PEDV地方流行毒株S基因的分析
1 材料與方法
1.1 樣品
1.2 主要試劑
1.3 主要儀器設備
1.4 引物設計
1.5 總RNA提取
1.6 獲得目的片段的方法
1.7 S 基因的分析
1.8 參考序列
1.9 PEDV S基因RT-PCR
1.9.1 RT-PCR擴增體系
1.9.2 RT-PCR擴增程序
1.10 PCR產物鑒定及純化回收
1.11 PCR產物連接與轉化
1.12 重組質粒提取、鑒定及序列測定
2. 結果與分析
2.1 S基因的RT-CR
2.2 PEDV流行毒株S基因與參考毒株的系統(tǒng)發(fā)育關系樹
2.2.1. 序列確定
2.2.2 PEDV S基因的系統(tǒng)發(fā)育樹
2.2.3 PEDV S基因與8株參考毒株同源性分析
3 討論
第四章 PEDV流行毒株和疫苗株S基因抗原表位表達
1 材料和方法
1.1 病毒、細胞、載體、感受態(tài)細胞
1.2 主要試劑
1.3 主要儀器設備
1.4 融合試劑盒的選擇
1.5 引物的設計
1.6 大腸桿菌原核表達載體和限制性內切酶的選擇
1.7 目的片段擴增引物和融合片段(S1P1-3)的鑒定引物
1.8 目的片段擴增
1.9 目的片段的融合和轉化
1.9.1 PCR產物電泳、回收
1.9.2 目的片段的融合
1.9.3 融合片段的轉化
1.10 重組質粒提取和鑒定
1.10.1 篩選菌落
1.10.2 堿裂解法提取質粒
1.10.3 重組質粒的鑒定
1.11 大腸桿菌原核表達載體pET32a(+)和含有融合片段的重組質粒PMD18-T的酶切、回收
1.11.1 酶切
1.11.2 回收
1.12 表達載體pET32a(+)與融合片段S1P1-3的連接
1.13 重組表達載體轉入DH5 α感受態(tài)細胞
1.14 重組表達載體轉入原核表達菌BL21
1.15 鑒定
1.16 表達
1.16.1 時間優(yōu)化
1.16.2 IPTG濃度優(yōu)化
1.17 SDS-PAGE
1.18 Western BLot
1.18.1 電泳分離
1.18.2 轉膜
1.18.3 雜交與顯色
2 結果和分析
2.1 S1基因3個片段的PCR擴增
2.2 載體和融合片段的酶切
2.3 重組質粒PCR鑒定
2.4 SDS-PAGE
2.5 Western-Blotting檢測
3 討論
第五章 結論
參考文獻
攻讀碩士期間的主要科研成果
項目資助
致謝
附錄
【參考文獻】：
期刊論文
[1]新發(fā)豬流行性腹瀉病毒ORF3基因的遺傳進化分析[J]. 董世娟,朱于敏,于瑞嵩,司伏生,石明明,張源淑,李震. 華中農業(yè)大學學報. 2014(05)
[2]仔豬流行性腹瀉的新特點與防控建議[J]. 楊漢春. 北方牧業(yè). 2013(13)
[3]2011年福建省豬流行性腹瀉的流行特點及其防治措施[J]. 張世忠,江斌. 福建畜牧獸醫(yī). 2012(02)
[4]豬流行性腹瀉的防治[J]. 廖啟富. 湖北畜牧獸醫(yī). 2012(03)
[5]國內豬流行性腹瀉防治概況[J]. 徐國棟,李峰,張廣峰. 畜牧與獸醫(yī). 2011(12)
[6]豬流行性腹瀉的特點與防控[J]. 李中興,毛雪紅. 農村養(yǎng)殖技術. 2011(23)
[7]豬流行性腹瀉流行特點及流行現狀的研究[J]. 甘振磊,湯德元,李春燕,王彬,張曉杰,王鳳,劉志杰. 豬業(yè)科學. 2010(12)
[8]豬流行性腹瀉的實驗室診斷方法[J]. 李思銀,楊亮宇,楊玉艾. 豬業(yè)科學. 2010(12)
[9]豬流行性腹瀉的實驗室診斷方法研究進展[J]. 劉濤,王瑞. 豬業(yè)科學. 2010(12)
[10]表達豬流行性腹瀉病毒中和抗原位點的重組干酪乳桿菌免疫小鼠誘導的免疫應答[J]. 葛俊偉,姜艷平,汪淼,喬薪瑗,劉敏,唐麗杰,李一經. 中國獸醫(yī)科學. 2010(07)
本文編號：3573761
【文章來源】：海南大學海南省 211工程院校
【文章頁數】：66 頁
【學位級別】：碩士
【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 綜述
1 PED的流行
1.1 國外流行情況
1.2 國內流行情況
2 PEDV的形態(tài)結構
3 PEDV的分類地位和分子特征
4 PED的診斷
4.1 RT-PCR法
4.2 ELISA法
4.3 免疫電鏡法
4.4 直接免疫熒光法
4.5 微量血清中和試驗
5 PED的治療
6 PED的疫苗研究
6.1 PED組織滅活苗
6.2 PED細胞滅活苗
6.3 PED弱毒苗
6.4 轉基因疫苗
6.4.1 植物疫苗
6.4.2 乳酸桿菌疫苗
7 選題的目的及意義
第二章 一株PEDV流行毒株全基因組的序列分析
1 材料與方法
1.1 樣品
1.2 主要試劑
1.3 主要儀器設備
1.4 引物設計
1.5 總RNA提取
1.6 獲得目的片段的方法
1.7 PEDV全基因的分析
1.8 參考序列
1.9 RT-PCR
1.9.1 RT-PCR擴增體系
1.9.2 RT-PCR擴增程序
1.10 PCR產物鑒定及純化回收
1.10.1 PCR產物鑒定
1.10.2 PCR產物的回收
1.11 PCR產物連接與轉化
1.11.1 連接
1.11.2 轉化
1.12 重組質粒提取、鑒定及序列測定
1.12.1 篩選菌落
1.12.2 堿裂解法提取質粒
1.12.3 重組質粒的鑒定
1.12.4 序列測定
2 結果
2.1 RT-PCR擴增結果
2.2 PEDV流行毒株SDZB_CH2014與64株參考毒株系統(tǒng)發(fā)育關系
2.3 S基因分析
2.3.1 S基因抗原性分析
2.3.2 S基因的B細胞線性表位分析
2.3.3 S基因的系統(tǒng)發(fā)育樹
2.4 ORF3系統(tǒng)發(fā)育關系樹
2.5 E基因系統(tǒng)發(fā)育關系樹
2.6 M基因系統(tǒng)發(fā)育關系樹
2.7 N基因系統(tǒng)發(fā)育關系樹
3 討論
第三章 2013-2014年PEDV地方流行毒株S基因的分析
1 材料與方法
1.1 樣品
1.2 主要試劑
1.3 主要儀器設備
1.4 引物設計
1.5 總RNA提取
1.6 獲得目的片段的方法
1.7 S 基因的分析
1.8 參考序列
1.9 PEDV S基因RT-PCR
1.9.1 RT-PCR擴增體系
1.9.2 RT-PCR擴增程序
1.10 PCR產物鑒定及純化回收
1.11 PCR產物連接與轉化
1.12 重組質粒提取、鑒定及序列測定
2. 結果與分析
2.1 S基因的RT-CR
2.2 PEDV流行毒株S基因與參考毒株的系統(tǒng)發(fā)育關系樹
2.2.1. 序列確定
2.2.2 PEDV S基因的系統(tǒng)發(fā)育樹
2.2.3 PEDV S基因與8株參考毒株同源性分析
3 討論
第四章 PEDV流行毒株和疫苗株S基因抗原表位表達
1 材料和方法
1.1 病毒、細胞、載體、感受態(tài)細胞
1.2 主要試劑
1.3 主要儀器設備
1.4 融合試劑盒的選擇
1.5 引物的設計
1.6 大腸桿菌原核表達載體和限制性內切酶的選擇
1.7 目的片段擴增引物和融合片段(S1P1-3)的鑒定引物
1.8 目的片段擴增
1.9 目的片段的融合和轉化
1.9.1 PCR產物電泳、回收
1.9.2 目的片段的融合
1.9.3 融合片段的轉化
1.10 重組質粒提取和鑒定
1.10.1 篩選菌落
1.10.2 堿裂解法提取質粒
1.10.3 重組質粒的鑒定
1.11 大腸桿菌原核表達載體pET32a(+)和含有融合片段的重組質粒PMD18-T的酶切、回收
1.11.1 酶切
1.11.2 回收
1.12 表達載體pET32a(+)與融合片段S1P1-3的連接
1.13 重組表達載體轉入DH5 α感受態(tài)細胞
1.14 重組表達載體轉入原核表達菌BL21
1.15 鑒定
1.16 表達
1.16.1 時間優(yōu)化
1.16.2 IPTG濃度優(yōu)化
1.17 SDS-PAGE
1.18 Western BLot
1.18.1 電泳分離
1.18.2 轉膜
1.18.3 雜交與顯色
2 結果和分析
2.1 S1基因3個片段的PCR擴增
2.2 載體和融合片段的酶切
2.3 重組質粒PCR鑒定
2.4 SDS-PAGE
2.5 Western-Blotting檢測
3 討論
第五章 結論
參考文獻
攻讀碩士期間的主要科研成果
項目資助
致謝
附錄
【參考文獻】：
期刊論文
[1]新發(fā)豬流行性腹瀉病毒ORF3基因的遺傳進化分析[J]. 董世娟,朱于敏,于瑞嵩,司伏生,石明明,張源淑,李震. 華中農業(yè)大學學報. 2014(05)
[2]仔豬流行性腹瀉的新特點與防控建議[J]. 楊漢春. 北方牧業(yè). 2013(13)
[3]2011年福建省豬流行性腹瀉的流行特點及其防治措施[J]. 張世忠,江斌. 福建畜牧獸醫(yī). 2012(02)
[4]豬流行性腹瀉的防治[J]. 廖啟富. 湖北畜牧獸醫(yī). 2012(03)
[5]國內豬流行性腹瀉防治概況[J]. 徐國棟,李峰,張廣峰. 畜牧與獸醫(yī). 2011(12)
[6]豬流行性腹瀉的特點與防控[J]. 李中興,毛雪紅. 農村養(yǎng)殖技術. 2011(23)
[7]豬流行性腹瀉流行特點及流行現狀的研究[J]. 甘振磊,湯德元,李春燕,王彬,張曉杰,王鳳,劉志杰. 豬業(yè)科學. 2010(12)
[8]豬流行性腹瀉的實驗室診斷方法[J]. 李思銀,楊亮宇,楊玉艾. 豬業(yè)科學. 2010(12)
[9]豬流行性腹瀉的實驗室診斷方法研究進展[J]. 劉濤,王瑞. 豬業(yè)科學. 2010(12)
[10]表達豬流行性腹瀉病毒中和抗原位點的重組干酪乳桿菌免疫小鼠誘導的免疫應答[J]. 葛俊偉,姜艷平,汪淼,喬薪瑗,劉敏,唐麗杰,李一經. 中國獸醫(yī)科學. 2010(07)
本文編號：3573761
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