發(fā)布時間：2017-05-11 12:18

  本文關鍵詞：基于噻唑橙和聚苯胺的DNA甲基化檢測方法研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：DNA甲基化是一種重要的表觀遺傳修飾方式,在甲基轉移酶的催化作用下,將甲基自由基選擇性地添加到DNA的CpG序列的胞嘧啶上,從而形成5-甲基胞嘧啶,通常發(fā)生在基因的5'-CG-3'序列(被稱為CpG島)。大量的科學研究表明,DNA甲基化涉及到很多細胞的調控過程,例如調控基因表達、胚胎發(fā)育、抑制轉錄、染色質結構、X-染色體失活、染色體結構重組、基因組印跡和染色體的穩(wěn)定性。在高等真核生物的正常細胞中,一般情況下CpG島是末甲基化,但是,異常甲基化會抑制遺傳信息的表達,會導致人類各種疾病,比如癌癥的發(fā)生。因此,DNA甲基化可以作為疾病的一種潛在生物標志。同時,甲基轉移酶在細胞分化和發(fā)育、基因的抑制、腫瘤和基因疾病中發(fā)揮了關鍵作用,所以甲基轉移酶的活性評價在藥物研發(fā)和臨床診斷的領域很重要。因此,發(fā)展一種迅速、簡單、高效、選擇性高的DNA甲基化和甲基轉移酶活性的檢測方法是刻不容緩的。本論文圍繞DNA甲基化和DNA甲基轉移酶的檢測開展了如下兩個工作：第一,我們發(fā)展了一種基于限制性內切酶HpaⅡ和外切酶III(Exo III)的無標記熒光檢測DNA甲基化和DNA甲基轉移酶活性的方法。設計了一種可與目標DNA雜交形成雙鏈DNA的無標記探針DNA。我們以從人p53基因外顯子8上截取了一段32堿基長度的DNA作為研究對象。由于HpaⅡ切割和ExoⅢ消化的作用,雙鏈DNA會變成單鏈DNA,導致噻唑橙的熒光強度減弱。但是,在雙鏈DNA上特定的序列被DNA甲基轉移酶甲基化后,就會抑制Jpan和Exo Ⅲ的功能,噻唑橙嵌入到雙鏈DNA中,從而發(fā)出很強的熒光。這種方法可以確定DNA上特定位點CpG的甲基化,同時我們進一步考察了由化學試劑二甲亞砜(DMSO)和乙醛(CH3CH0)引起的甲基化。對人血清樣品的分析,表明此方法在進一步應用到復雜的生物胖品中有著巨大的潛力。第二,發(fā)展了一種基于限制性內切酶HpaⅡ和HRP模擬酶(bemin/G-quadruplex DNAzyme)誘導聚苯胺合成的甲基轉移酶活性檢測方法。其中HRP模擬酶作為一種強催化劑,催化雙氧水誘導苯胺在電極表面的DNA上聚合生成聚苯胺(PANI),進而聚苯胺作為本實驗中的氧化還原信號分子。電極表面先修飾捕獲探針(S1),然后與目標DNA (S2)雜交形成雙鏈DNA。在沒有甲基轉移酶存在的情況下,雙鏈DNA就會被HpaⅡⅡ切割,那么DANzyme DNA (S3)就不能與電極上的DNA雜交,繼而HRP模擬酶也就不會形成。苯胺不能在電極表面聚合,就不會有電流信號。但是,在甲基轉移酶存在的情況下,雙鏈DNA會被甲基化,就會抑制HpaⅡ的切割功能。HRP模擬酶順利在電極表面形成,催化H2O2誘導苯胺聚合。由于聚苯胺的生成,就會有強的電流信號。這種方法可以準確地檢測特定位點CpG的甲基化。同時也對人血清中檢測DNA甲基轉移酶活性的效果進行了驗證。另外,我們還研究這種方法在甲基轉移酶抑制劑篩選中的應用。
【關鍵詞】：DNA甲基化 甲基轉移酶 限制性內切酶 噻唑橙 聚苯胺 熒光檢測 電化學檢測
【學位授予單位】：東南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：Q78
【目錄】：

• 摘要4-5
• Abstract5-9
• 第一章 緒論9-18
• 1.1 DNA甲基化概述9-11
• 1.1.1 CpG島9-10
• 1.1.2 DNA甲基化的生成10
• 1.1.3 DNA甲基化與腫瘤10-11
• 1.2 影響DNA甲基化的因素11-14
• 1.2.1 DNA甲基轉移酶11-12
• 1.2.2 組蛋白甲基化12
• 1.2.3 飲食等環(huán)境因素12-13
• 1.2.4 RNA干擾13-14
• 1.2.5 病毒感染14
• 1.3 DNA甲基化的檢測方法14-17
• 1.3.1 重亞硫酸鹽測序法14-15
• 1.3.2 高效液相色譜15
• 1.3.3 高效毛細管電泳法15
• 1.3.4 甲基化敏感性限制內切酶法15-16
• 1.3.5 甲基化結合蛋白分析方法16-17
• 1.4 本文研究的內容17-18
• 第二章 基于限制性內切酶和外切酶Ⅲ的無標記熒光檢測DNA甲基化和甲基轉移酶活性18-29
• 2.1 引言18-20
• 2.2 實驗部分20-21
• 2.2.1 試劑和儀器20
• 2.2.2 探針DNA與目標DNA雜交20
• 2.2.3 DNA甲基化及限制性內切酶和外切酶Ⅲ的作用20-21
• 2.2.4 由化學試劑引起的DNA甲基化21
• 2.2.5 在血清中檢測M.SssI甲基轉移酶活性21
• 2.3 結果與討論21-28
• 2.3.1 噻唑橙的熒光性能和它的濃度優(yōu)化21-22
• 2.3.2 HpaⅡ和ExoⅢ的功能驗證及它們的濃度優(yōu)化22-23
• 2.3.3 目標DNA檢測及驗證其選擇性23-25
• 2.3.4 DNA甲基化及甲基轉移酶活性的檢測25-26
• 2.3.5 化學試劑甲基化的檢測26-27
• 2.3.6 在人血清中檢測M.SssI甲基轉移酶的活性27-28
• 2.4 本章小結28-29
• 第三章 基于限制性內切酶HpaⅡ和聚苯胺的無標記電化學檢測甲基轉移酶活性29-41
• 3.1 引言29-31
• 3.2 實驗部分31-33
• 3.2.1 試劑和儀器31
• 3.2.2 捕獲探針DNA修飾金電極的制備31-32
• 3.2.3 捕獲DNA與目標DNA雜交32
• 3.2.4 DNA甲基化及限制性內切酶HpaⅡ和外切酶Ⅲ的作用32
• 3.2.5 HRP模擬酶和聚苯胺的形成32
• 3.2.6 抑制劑對M.SssI甲基轉移酶活性的抑制32-33
• 3.2.7 電化學測試33
• 3.3 結果與討論33-40
• 3.3.1 聚苯胺的電化學性能33-35
• 3.3.2 電化學檢測M.SssI甲基轉移酶活性35-38
• 3.3.3 在人血清中測定M.SssI甲基轉移酶的活性38-39
• 3.3.4 不同濃度抑制劑對M.SssI甲基轉移酶活性的抑制39-40
• 3.4 本章小結40-41
• 第四章 總結與展望41-42
• 參考文獻42-52
• 致謝52-53
• 作者簡介53

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