耐鹽酶類及基因?qū)τ诟啕}環(huán)境中微生物的生長代謝具有重要作用,并在海產(chǎn)品加工、洗滌等生物技術(shù)領域廣泛應用。相對高滲的胃腸道腔（⁰.3 mol/L NaCl）及飲食變化可導致動物胃腸道中滲透壓的產(chǎn)生,因此胃腸道微生物中可能蘊藏著豐富的耐鹽酶類及基因資源。本文以倭蜂猴及大額牛胃腸道微生物為研究對象,從已構(gòu)建的宏基因組文庫中篩選耐鹽克隆并測序,分析潛在的耐鹽酶類及基因,并進一步對6-磷酸海藻糖水解酶進行異源表達及鑒定,以挖掘胃腸道微生物宏基因組中的耐鹽酶類及基因,為探究胃腸道微生物的耐鹽機理及該環(huán)境中耐鹽酶類和基因的開發(fā)利用奠定理論基礎。研究結(jié)果總結(jié)如下:1.胃腸道微生物宏基因組文庫中耐鹽克隆的篩選、測序及分析以7%NaCl（w/v）為篩選因子,從倭蜂猴和大額牛胃腸道微生物宏基因組文庫中分別獲得4個（1A、3-1、5₁₁、5₁₅）和6個（21₉A、24₇H、16₂E、16₂D、16₈

【文章來源】：云南師范大學云南省

【文章頁數(shù)】：97 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

質(zhì)粒測序?qū)嶒灹鞒?br>

第二章胃腸道微生物宏基因組耐鹽克隆的篩癬測序及潛在耐鹽酶類及基因分析25物宏基因組文庫中獲得31個耐鹽克隆，部分克隆在7%NaCl條件下培養(yǎng)24h的生長狀況如圖2.2所示。所獲48個耐鹽克隆的OD600值均高于對照，在0.236–1.471之間，其中，在含鹽培養(yǎng)基中生長最快的克隆是5_1_1，克隆1_2B則耐受7%NaCl(w/v)能力最弱。而在含7%NaCl培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h，對照E.coliEPI300-C菌株的OD600值基本無變化。上述結(jié)果表明，耐鹽克隆的pCC1FOS載體上可能已插入微生物耐鹽基因片段。圖2.2部分耐鹽克隆生長狀況Figure2.2Screeningofsomesalt-tolerantclonesoffosmidlibrary2.3.2耐鹽克隆對不同鹽濃度的耐受性分析選取耐鹽性較好的10個克隆（來自倭蜂猴糞便微生物宏基因組文庫的4個克隆1A、3-1、5_1_1、5_1_5和來自大額牛糞便為生物宏基因組文庫的6個克隆21_9A、24_7H、16_2E、16_2D、16_8H、1_2G）進行不同鹽濃度耐受研究，結(jié)果如圖2.3所示。隨著NaCl濃度（5%9%(w/v)）的增加，克隆1A、3-1、5_1_1、5_1_5、21_9A、24_7H、16_2E、16_2D、16_8H、1_2G的OD600值基本保持穩(wěn)定，與對照相比表現(xiàn)出顯著耐鹽性。

第二章胃腸道微生物宏基因組耐鹽克隆的篩癬測序及潛在耐鹽酶類及基因分析26圖2.3部分耐鹽克隆對不同鹽濃度的耐受情況Figure2.3Salttoleranceofsomesalttoleranceclonesagainstdifferentsaltstresslevels2.3.3高通量測序和基因功能分析2.3.3.1高通量測序及序列分析為了從胃腸道獲得耐鹽基因和酶類，我們對10個耐鹽克隆的FosmidDNA進行高通量測序，序列數(shù)據(jù)統(tǒng)計見表2.5。所有樣品共獲得100,909,958條rawreads，總長為15,136,493,700bps。過濾測序質(zhì)量值低的reads后共獲得94,533,758個cleanreads，總長14,161,779,631bp。組裝后共得到245個scaffolds，其總長為1,221,827bp。使用Prodigal（v2.6.3）進行基因組編碼基因預測共獲得1285個基因。

【參考文獻】：
期刊論文
[1]滇金絲猴糞便微生物來源的β-半乳糖苷酶基因的表達及酶學性質(zhì)[J]. 張文洪,楊雁霞,楊正鳳,黃遵錫,李俊俊,唐湘華,楊云娟,吳倩,慕躍林,韓楠玉,許波.  微生物學報. 2019(08)
[2]宏基因組來源β-半乳糖苷酶的異源表達與酶學性質(zhì)研究[J]. 楊正鳳,楊雁霞,張文洪,黃吉芬,黃遵錫,許波.  云南師范大學學報(自然科學版). 2018(04)
[3]基于高通量測序的花馬鹽湖原核微生物及其耐鹽基因[J]. 劉開輝,張波,丁小維,楊學英,鄧百萬,蘭阿峰,彭浩,牛明月,米洋.  微生物學報. 2018(10)
[4]傳統(tǒng)食品發(fā)酵環(huán)境宏基因組中酯酶基因的克隆、表達及性質(zhì)分析[J]. 葉茂,鄧毛程,劉慧平,李靜.  現(xiàn)代食品科技. 2017(08)
[5]未培養(yǎng)微生物的培養(yǎng)方法進展[J]. 范念斯,齊嶸,楊敏.  應用與環(huán)境生物學報. 2016(03)
[6]宏基因組學在纖維素酶研究中的應用進展[J]. 戴利銘,熊彩云,黃遵錫,李俊俊,唐湘華,楊云娟,許波.  微生物學通報. 2015(06)
[7]嗜鹽菌耐鹽機制相關基因的研究進展[J]. 王偉偉,唐鴻志,許平.  微生物學通報. 2015(03)
[8]一種耐鹽性谷氨酰胺酶在高鹽稀態(tài)醬油釀造過程中的應用研究[J]. 葉茂,張遠平,鄧毛程.  中國調(diào)味品. 2014(07)
[9]宏基因組學在人和動物胃腸道微生物研究中的應用進展[J]. 許波,楊云娟,李俊俊,唐湘華,慕躍林,黃遵錫.  生物工程學報. 2013(12)
[10]高糖土壤微生物宏基因組文庫的構(gòu)建及β-葡萄糖苷酶基因鑒定[J]. 陸堅,杜麗琴,龐浩,馬貴,韋宇拓,黃日波.  基因組學與應用生物學. 2013(01)

博士論文
[1]基于嗜耐鹽菌基因組分析與深海宏基因組文庫的酯酶研究[D]. 江夏薇.浙江大學 2013
[2]云斑天牛胃腸道內(nèi)共生細菌來源的纖維素酶和半纖維素酶的初步研究[D]. 周峻沛.中國農(nóng)業(yè)科學院 2010
[3]耐鹽微生物的分離及兩株耐鹽真菌次級代謝產(chǎn)物的研究[D]. 王文良.中國海洋大學 2008
[4]鹽生植物（補血草與鹽地堿蓬）耐鹽基因的發(fā)掘及應用[D]. 郭善利.山東師范大學 2005

碩士論文
[1]陜北花馬鹽湖原核微生物多樣性及耐鹽逆境研究[D]. 張波.陜西理工學院 2016
[2]滇金絲猴糞便微生物木聚糖降解酶研究[D]. 戴利銘.云南師范大學 2016
[3]紅樹林生境新型酯酶的基因克隆、酶學性質(zhì)研究及紅樹林水體宏轉(zhuǎn)錄組文庫的構(gòu)建[D]. 李長杰.中山大學 2013
[4]山羊瘤胃宏基因組中葡聚糖酶/木聚糖酶的篩選與性質(zhì)分析[D]. 冷園園.山東大學 2012
[5]宏基因組文庫高通量篩選古鹽井中嗜鹽微生物耐鹽基因[D]. 梁華忠.西華大學 2012
[6]嗜鹽（耐鹽）微生物的分離及其在榨菜廢水處理中的應用[D]. 沈宇強.浙江大學 2008



本文編號：3521871