基因表達(dá)的原位檢測(cè)能夠在細(xì)胞和組織層面上提供其空間位置信息,受到廣泛的關(guān)注和應(yīng)用。但同一基因通過選擇性剪接可能產(chǎn)生多個(gè)具有不同時(shí)空特異表達(dá)的剪接體,最終不同的剪接體翻譯成蛋白并行使生物學(xué)功能。因此,探索基因選擇性剪接的空間表達(dá),具有重要的生物學(xué)意義。本文旨在開發(fā)一種新型RNA多重原位檢測(cè)技術(shù),并應(yīng)用于造血干細(xì)胞中的具有高度細(xì)胞特異性的基因選擇性剪接的研究中。首先,我們利用人類血液腫瘤細(xì)胞系K562作為研究的基礎(chǔ)模型,其能分化成為成熟血細(xì)胞（Erythroblasts,EBs）和巨核細(xì)胞（Megakaryocytes,MKs）,通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)K562的分化效率,利用RNA原位檢測(cè)技術(shù)對(duì)特異性表達(dá)的基因進(jìn)行細(xì)胞層面的空間定位,并與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-seq）所得的基因表達(dá)值進(jìn)行比較,證實(shí)方法對(duì)于基因表達(dá)檢測(cè)的可行性。其次,基于K562,EBs和MKs的RNA-seq數(shù)據(jù)分析,我們挑選選擇性剪接事件進(jìn)行RNA原位檢測(cè)實(shí)驗(yàn),并進(jìn)一步優(yōu)化為RNA多重原位檢測(cè)。結(jié)合測(cè)序分析的結(jié)果選擇12種環(huán)狀RNA（Circular RNA,circRNA）在K562、EBs這兩種細(xì)胞系上進(jìn)行檢測(cè)。利用該方法... 

【文章來源】：華僑大學(xué)福建省

【文章頁(yè)數(shù)】：111 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

不同類型的選擇性剪接原理示意圖

第1章緒論3細(xì)胞均源自于少量的造血干細(xì)胞（Hematopoieticstemcells,HSCs）增值分化的造血祖細(xì)胞（Hematopoieticstemandprogenitorcell,HSPC）[37]。HSCs具有高度自我更新與自我分化兩大特性，維持著人體的穩(wěn)態(tài)與再生。如圖1.2所示，根據(jù)造血干細(xì)胞的分化時(shí)期及功能作用，造血干細(xì)胞分為長(zhǎng)效重建造血干細(xì)胞（Long-termhematopoieticstemcell,LT-HSC）和短效重建造血干細(xì)胞（Short-termhematopoieticstemcell,ST-HSC）。進(jìn)而ST-HSC通過其不對(duì)稱的分化，產(chǎn)生多能祖細(xì)胞（Multipotentprogenitorcell,MPP）[39]，MPP進(jìn)一步分化為共同髓系祖細(xì)胞（Commonmyeloidprogenitorcell,CMP）和共同淋巴系祖細(xì)胞（CommonlympHoidprogenitorcell,CLP），接下來CMP進(jìn)一步分化成各種髓系祖細(xì)胞。髓系多能祖細(xì)胞分化成巨核細(xì)胞/紅細(xì)胞祖細(xì)胞（Megakaryocyteerythrocyteprogenitor,MEP）和粒、單核系祖細(xì)胞（Granulocytemonocyteprogenitor,GMP），這些祖細(xì)胞進(jìn)一步增殖分化成為成熟血細(xì)胞和巨核細(xì)胞[40]，而與之對(duì)應(yīng)的CLP分化成各種類型的淋巴細(xì)胞，如自然殺傷細(xì)胞（Naturalkillercell,NKcell）及T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞。圖1.2骨髓中造血干細(xì)胞分化類型

華僑大學(xué)碩士學(xué)位論文6環(huán)擴(kuò)增（Rollingcircleamplification,RCA）[109-110]放大技術(shù)相結(jié)合的原理，實(shí)現(xiàn)單分子RNA的原位檢測(cè)技術(shù)。PLP在1994年由NilssonM等人[111]提出，他們將鎖式探針設(shè)計(jì)為兩端為與靶序列的互補(bǔ)配對(duì)的序列，中間為無關(guān)序列的形式，最后利用T4DNAligase連接成環(huán)。UlfLandegren的科研團(tuán)隊(duì)[112]在實(shí)驗(yàn)中，對(duì)鎖式探針與靶序列進(jìn)行對(duì)比，在B球蛋白基因中成功對(duì)其進(jìn)行分型，從而證實(shí)了PLP的可行性。RCA是一種利用滾環(huán)復(fù)制方式的擴(kuò)增技術(shù)，結(jié)合Phi29DNA聚合酶[113-116]，能夠?qū)⑻囟ǖ腄NA、RNA分子的靶核酸信號(hào)放大[117-120]，最高可達(dá)到107放大倍數(shù)，并且由于其具有極高靈敏度等特點(diǎn)，目前RCA技術(shù)已廣泛應(yīng)用于線粒體DNA[124-125]、mRNA[126]及miRNA[121-122]等的原位檢測(cè)。第四代的原位測(cè)序技術(shù)（Insitusequencing,ISS）正是基于PLP與RCA的結(jié)合原理開發(fā)應(yīng)用的。2014年KeR等人[123]利用ISS首次實(shí)現(xiàn)了對(duì)固定細(xì)胞和乳腺癌組織中長(zhǎng)達(dá)四個(gè)堿基的單分子RNA的測(cè)序技術(shù)（如圖1.3）。該方法在保留了其空間位置信息之余，又獲取到了目的基因的序列；同時(shí)，研究者指出，即使測(cè)序長(zhǎng)度為四個(gè)堿基，仍可以利用熒光標(biāo)記基團(tuán)空間排列組合的原理，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)單分子RNA的44=256種的多重原位檢測(cè)。圖1.3RNA原位測(cè)序原理圖（引自KeR等）


本文編號(hào)：3451276